培养基组合物及促进动物胚胎体外发育的培养方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及培养基组合物及促进动物胚胎体外发育的培养方法。本发明专利技术的优点在于能够显著提高猪体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)胚胎的体外发育效率。在正常的PZM‑3的胚胎培养液中的SCNT胚胎囊胚率是18％～20％，采用换液的方法可以显著提高猪SCNT的囊胚率到45.7％，同使用正常胚胎培养液PZM‑3的囊胚率相比，囊胚率提高了25.7％。同时，此方法还操作方便，只要在SCNT胚胎激活24～48h后从PZM‑3(‑)的培养基中换液到PZM‑3‑Glutamax中继续培养即可，操作简单方便，适宜后续应用。

【技术实现步骤摘要】
培养基组合物及促进动物胚胎体外发育的培养方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及培养基组合物及促进动物胚胎体外发育的培养方法。
技术介绍
早在1962年，人们就在两栖类利用体细胞核移植技术将终末分化的体细胞重编程到全能性状态。自从1997年首例哺乳动物克隆在羊上取得成功，现已获得超过20种克隆的哺乳动物。利用SCNT技术可以从单个体细胞的细胞核中生产出一个完整的生物体，因此这项技术在研究生物反应器，生产珍贵的医用蛋白、生产异种器官移植的供体、加速家畜的遗传改良过程及濒危物种保护等方面具有极大的应用潜能。此外，从SCNT囊胚中可以分离得到多能性胚胎干细胞，这使得SCNT有望成为一种人类疾病治疗的新技术。近年来随着首例人类核移植胚胎干细胞系的成功建立，以及来源于老人或患者细胞的人类核移植胚胎干细胞的获得，使得这种期望更加趋近实现。核移植胚胎干细胞可以作为构建疾病模型和细胞组织替代治疗的有效细胞来源。虽然小鼠、家兔在研究重编程机制方面较为方便，但是由于其体型、生理学特征、短暂的生命周期等原因，以其推断克隆技术在人类临床应用上的安全性具有很大的缺陷；就相似性而言，猴子是十分理想的模式动物，但在某种程度上，猴子仍然涉及到了伦理道德问题，并且其饲养与繁殖十分困难。猪在免疫学与生理学上与人类十分类似，其器官在大小、结构、功能上都与人相似，并且在人与猪之间进行器官移植产生疾病的概率较低，所以它是人类器官移植的理想来源。另外，猪的平均生命周期超过20年，可以进行长期的靶向实验，因此以猪作为研究对象具有许多其它动物模型无可比拟的优势。此外，猪作为我国最重要的产肉动物之一，体细胞核移植技术对于培育适合市场需要的优良种猪，实现高产、优质、高效的现代养猪生产，以及对其遗传育种的高效改良都将发挥巨大作用。尽管已经进行了深入的研究与探讨，但人们对SCNT胚胎发育过程中表观遗传重编程的潜在机制依然知之甚少，目前仍存在一些阻碍SCNT实际应用的限制。其中之一就是生产克隆动物的效率较低。例如，将近50％的小鼠SCNT胚胎在植入前表现出发育阻滞，只有1％-2％的胚胎在移植到代孕母鼠中可以发育到个体。猪的效率还不到1％，绵羊效率为5-8％，牛的有10-15％。因此，致力于寻找提高猪克隆效率的方法对于促进猪体细胞核移植技术的广泛应用具有重要作用。为了提高重编程效率，人们尝试了很多的方法，包括选择激活重构胚的时机，胞质分裂抑制剂的影响，去核和注核时机的影响，电融合法(Oguraetal.,2000)以及显微操作技术方面的影响，但都没有取得显著的效果。考虑到DNA甲基化和组蛋白乙酰化都是影响体细胞重编程和克隆胚胎发育的重要表观遗传标记，人们研究了用病理学药剂改变供体细胞和胚胎的表观遗传修饰来提高体细胞重编程的效率。研究发现，SAH(S-adenosyl-homocysteine)处理供体细胞后能够显著提高克隆胚胎的体外发育率到32.4％，而TSA处理供体细胞或者重构胚均能够显著提高囊胚率到40％。但是这些药物对克隆胚胎长期影响及应用还有待研究。研究发现，体外培养环境对胚胎发育也有重要的影响。那么，改变体外培养条件或者优化体外培养环境是否可以提高克隆胚胎体外发育能力呢？Chatot等通过对小鼠2细胞胚胎阻滞的研究发现，培养液中的葡萄糖在胚胎发育早期可能抑制一些关键的代谢过程，而谷氨酰胺是胚胎早期发育过程中首选的能量来源。体细胞胞质中的各个独立区域和分子团是依培养环境中成分的变化而重新定位的，表观遗传状态会受到培养环境的影响，例如培养液中的血清能改变与基因组印迹相关的表观遗传信息。Michele等研究发现，与那些正常受精合子不同，克隆胚胎的囊胚率和多能性标记Oct4在囊胚中的区域性分布高度依赖于核移植后的培养环境。第一个细胞周期以后，体细胞核的表观遗传修饰仍在继续；重构胚中核重塑的改变是有利于还是不利于建立合子基因程序要依赖于培养液中的特异物质(Micheleetal.,2005)。Heindryckx等用CZB、G1/G2和KSOM/G2培养克隆和孤雌胚胎的研究发现，克隆胚胎和孤雌胚胎对体外培养环境非常敏感，选择的培养液是否合适将显著影响胚胎的体外发育。由此可见，体外培养环境对小鼠来源的胚胎的发育是非常关键的，这也提示我们除了以上报道的提高克隆效率的方法外，研究和选择更好的胚胎体外培养体系将是影响猪胚胎尤其是克隆胚胎体外发育的重要因素。使用现有SCNT技术产生的猪SCNT胚胎发育效率低，囊胚质量差。现有的提高胚胎发育效率的方法都效果不显著，而且操作方法不够便利。因此，提供一种能够通过简单换液就能完成的显著提高猪SCNT胚胎发育率和囊胚质量的培养基和培养方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了培养基组合物及促进动物胚胎体外发育的培养方法。本专利技术采用一种改良的胚胎培养方法，显著提高猪SCNT胚胎的体外发育效率和囊胚质量。现有技术猪体细胞核移植胚胎体外发育效率较低，囊胚质量较差，还没有找到显著提高效率的有效方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：在平时的培养过程中，本申请人发现，不同的培养液支持胚胎发育的时期不一样，有的培养液对胚胎早期发育很好，有的对后期发育好，因此，本申请人认为，将不同的培养液组合使用，各取优点，可以找到一个更能促进猪SCNT胚胎体外发育的培养体系。试验证明，确实能够得到这种培养体系，能显著提高了克隆胚胎的发育率。本专利技术提供了培养基组合物，包括PZM-3(-)和PZM-3-Glutamax；所述PZM-3(-)包括如下组分：所述PZM-3-Glutamax包括如下组分：在本专利技术的一些具体实施方案中，所述PZM-3(-)包括如下组分：所述PZM-3-Glutamax包括如下组分：或PZM-3(-)配方如下：PZM-3-Glutamax包括如下组分：或PZM-3(-)配方如下：PZM-3-Glutamax包括如下组分：本专利技术还提供了所述的培养液组合物在促进动物胚胎体外发育中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述动物包括猪，所述胚胎包括克隆胚胎。本专利技术还提供了所述的培养基组合物在促进动物体细胞重编程中的应用。本专利技术还提供了促进动物胚胎体外发育的培养方法，采用所述的培养基组合物培养所述动物胚胎。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述培养方法具体为：获得动物胚胎，融合激活后以30个/60μL的密度在所述改良的PZM-3(-)的培养基中培养24～48h后，换液到所述改良的PZM-3-Glutamax中继续培养7d至形成囊胚。本专利技术还提供了，所述培养的条件为38.5℃，5％CO2。本专利技术提供的方法关键在于不同的发育阶段使用不同的培养基进行胚胎培养，特别是在发育阻滞的关键阶段使用利于突破发育阻滞的培养液，即2倍提高培养液中的谷氨酰胺的浓度。主要有两本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.培养基组合物，其特征在于，包括PZM-3(-)和PZM-3-Glutamax；/n所述PZM-3(-)包括如下组分：/n

【技术特征摘要】
1.培养基组合物，其特征在于，包括PZM-3(-)和PZM-3-Glutamax；
所述PZM-3(-)包括如下组分：



所述PZM-3-Glutamax包括如下组分：








2.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述PZM-3(-)包括如下组分：






所述PZM-3-Glutamax包括如下组分：





3.如权利要求1或2所述的培养液组合物在促进动物胚胎体外发育中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子义，代相鹏，翟岩辉，孔祥杰，张胜，安星兰，李奇，张楠，
申请(专利权)人：吉林大学第一医院，
类型：发明
国别省市：吉林;22