一种化学培养体系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种化学培养体系及其应用，所述化学培养体系包含基础培养基、小分子化合物，形成化学成分明晰的无血清培养体系。本发明专利技术大大提高了神经细胞培养活力及体外生存时间。本发明专利技术不采用目前广泛使用的使用含有动物源性成分的代血清B27及GS21，而使用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，成分明确，避免了血清及动物源性成分的存在带来的潜在危险，因此本发明专利技术大大拓展了神经细胞移植的临床前景。

【技术实现步骤摘要】
一种化学培养体系及其应用
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种化学培养体系及其应用。
技术介绍
神经退行性疾病是目前常见的老龄化疾病，治疗及护理费用极其昂贵，而且市面上无特效药物可以进行有效的治疗。神经退行性疾病包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默症(AD)等疾病。世界卫生组织统计，2050年我国神经退行性疾病患者将超过3000万，预期医疗费用将超过1万亿。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴、神经核团毁损术或脑深部电刺激手术等治疗方法，但均不能达到很好的疗效，并且会带来“异动症”或是“药效波动”等严重影响生活质量的不良反应。除神经退行性疾病之外，脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是常见的一种神经系统创伤性疾病，据国外统计SCI患者一生的治疗康复费用平均达75万美元以上，美国每年对SCI患者的花费超过60亿美元。我国的患病率更是高于欧美发达国家，昂贵的治疗费用，长时间的康复治疗以及劳动力的丧失给个人及家庭带来的巨大影响，也给社会带来沉重的负担。神经退行性疾病和脊髓损伤的治疗难点在于中枢神经系统的神经细胞具有不可再生性，而这类疾病是由于中枢神经的不可逆损伤造成。目前，神经细胞的移植是最为有效的一种治疗方式。神经细胞包括神经干细胞，成熟神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等不同神经细胞类型。目前，神经干细胞的异体移植已经在临床上取得了一定的效果。部分临床试验采取神经系统细胞系移植方法，但现存的神经细胞系资源有限，多为神经系统肿瘤细胞系，且在建系过程中存在EB病毒带来的不稳定因素；而异体神经细胞由于体外传代不易，且异体神经干细胞由于伦理限制以及获得技术不便，这些因素都进一步阻碍了以上疾病的临床推进。近年来，胚胎干细胞及诱导多能干细胞技术(iPSC)的开展取得了很大的进展，利用这类细胞进行定向分化可以获得多种类型的成体细胞(Cell，2006，124(4)pp.663-676；Cell，2007，131(5)pp.861-872)。因此，使用包括胚胎干细胞及iPSC在内的全能干细胞或者多能干细胞作为原材料进行神经细胞诱导分化可以作为临床治疗的新思路，大大拓展了神经细胞在临床医学上的应用潜力。从多能干细胞到神经干细胞，目前应用最为广泛的诱导方法有两种，第一种为两步法：首先细胞聚合成团形成拟胚体(embryonicbodies)，之后细胞进一步被诱导成为神经元细胞。这种方法的缺点在于细胞分化不同步，且神经元细胞的纯度不高；此外，动物源性的生长因子的使用也制约了神经元细胞在临床上的使用。第二种为SMAD途径双重抑制法(DualSMADinhibition)(NatBiotechnol，2009，05；27(5)：485)，该方法得到的神经干细胞能够分化为其它类型的神经元细胞，其原理是通过抑制BMP和TGFB途径来模拟胚胎发育早期的信号途径，从而诱导神经干细胞的产生。通过这种方法，可以在血清类成分(KnockoutSerumReplacement)的存在下得到诱导感觉神经元(NatBiotechnol，2009，05；27(5)：485)。虽然可应用于移植的细胞种类大大增加，但是目前神经细胞的体外培养大多依赖血清成分的存在，例如胎牛血清和目前广泛使用的代血清B27系列(ThermoFisher)，GS21(G0800,Sigma-Aldrich)，这类代血清含有动物源性成分，因此存在一系列安全隐患，它们的存在大大限制了神经细胞移植的的临床应用。因此，不含有血清成分神经系统基础培养基的开发对于神经系统再生医学的发展至关重要。基于现有技术中存在的技术问题，有必要研究一种新型神经系统无血清培养基，不采用目前广泛使用的使用含有动物源性成分的代血清B27及GS21等。通过使用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，成分明确，从而拓展神经细胞移植的临床前景。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种化学培养体系，用纯化学分子激活信号途径，使用非动物源性的生长因子替换动物源性的生长因子，避免血清及动物源性成分的存在带来的潜在危险。为解决上述问题，本专利技术提供了一种化学培养体系，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括小分子化合物，所述小分子化合物为：哌啶醇氧化物、木犀草素，D(+)-半乳糖，重组人转铁蛋白中的一种或者多种。进一步地，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、D(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白中的至少两种。进一步地，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、D(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白。进一步地，所述哌啶醇氧化物的用量为10nM-200uM；优选50nM、100nM、500nM、1uM、5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、150uM或200uM。进一步地，所述木犀草素的用量为5uM-150uM；优选5uM、10uM、50uM、75uM、100uM或150uM。进一步地，所述D(+)-半乳糖的用量为5-25ug/ml；优选5.5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml、12.5ug/ml、15ug/ml、17.5ug/ml、20ug/ml、22.5ug/ml或25ug/ml。进一步地，所述重组人转铁蛋白的用量为50-200ng/ml；优选55ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml或200ng/ml。进一步地，所述基础培养基为DMEM培养基或者DMEM/F12培养基，所述基础培养基包含最低必须培养基非必需氨基酸。进一步地，本专利技术提供的化学培养体系中所述添加剂还包括生长因子及无机盐。进一步地，所述生长因子包括维生素、黄体酮、腐胺及胰岛素；所述无机盐包括氯化钠、亚硒酸钠。进一步地，所述维生素包括1ug/ml维生素E，1.2uM维生素B12，64mg/L维生素C；所述黄体酮为6.3ng/ml，所述腐胺为23ug/ml，所述胰岛素为22ug/ml；所述氯化钠为0.5g/L，所述亚硒酸钠为13.6ug/L。本专利技术的另一个目的在于，提供所述化学培养体系在原代神经细胞培养和神经细胞系培养中的应用。本专利技术的另一个目的在于，提供所述化学培养体系在多能干细胞向神经干细胞诱导中的应用。本专利技术的另一个目的在于，提供所述化学培养体系在诱导干细胞神经定向分化及分化细胞培养中的应用。进一步地，所述应用包括星状胶质细胞分化、DRG神经元分化培养或皮质神经元分化培养；进一步地，所述DRG神经元分化及培养过程加入细胞因子；所述皮质神经元分化培养过程中加入化学小分子抑制剂。本专利技术的还有一个目的在于，提供所述化学培养体系在类脑器官诱导中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1.本专利技术使用一种或多种新的化学小分子，结合基础培养基以及无机盐及生长因子的组合，能够支持多种神经元的体外诱导，从而建立了无血清无动物源性物质的感觉神经元细胞诱导培养体系，并且可以表现出更佳的诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学培养体系，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括小分子化合物，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素，D(+)-半乳糖，重组人转铁蛋白中的一种或者多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种化学培养体系，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；所述添加剂包括小分子化合物，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素，D(+)-半乳糖，重组人转铁蛋白中的一种或者多种。


2.根据权利要求1所述的化学培养体系，其特征在于，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、D(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白中的至少两种。


3.根据权利要求1所述的化学培养体系，其特征在于，所述小分子化合物为哌啶醇氧化物、木犀草素、D(+)-半乳糖、重组人转铁蛋白。


4.根据权利要求1所述的化学培养体系，其特征在于，所述哌啶醇氧化物的用量为10nM-200uM。


5.根据权利要求4所述的化学培养体系，其特征在于，所述哌啶醇氧化物的用量为50nM、100nM、500nM、1uM、5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、150uM或200uM。


6.根据权利要求1所述的化学培养体系，其特征在于，所述木犀草素的用量为5uM-150uM。


7.根据权利要求6所述的化学培养体系，其特征在于，所述木犀草素的用量为5uM、10uM、50uM、75uM、100uM或150uM。


8.根据权利要求1所述的化学培养体系，其特征在于，所述D(+)-半乳糖的用量为5-25ug/ml。


9.根据权利要求8所述的化学培养体系，其特征在于，所述D(+)-半乳糖的用量为5.5ug/ml、7.5ug/ml、10ug/ml、12.5ug/ml、15ug/ml、17.5ug/ml、20ug/ml、22.5ug/ml或25ug/ml。


10.根据权利要求1所述的化学培养体系，其特征在于，所述重组人转铁蛋白的用量为50-200ng/ml。


11.根据权利要求10所述的化学培养体系，其特征在于，所述重组人转铁...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏君，蔡萌，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42