一种工程化神经细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种工程化神经细胞及其制备方法和应用。所述工程化神经细胞来源于工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞，所述质粒包括pTet‑O‑Ngn2‑puro、Tet‑O‑FUW‑EGFP和FUdeltaGW‑rtTA。本发明专利技术中，通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β‑淀粉样蛋白诱导所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供性质均一、可重复的实验材料。

【技术实现步骤摘要】
一种工程化神经细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种工程化神经细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
阿尔茨海默症(Alzheimer’sDisease，AD)是一种以β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉积、神经原纤维缠结(NFTs)和老年斑(SP)形成为主要特征的神经退行性疾病。目前，AD是神经疾病领域的重要攻关对象，而理想的AD模型则是探究其发病机制与新药研发的重要基础，AD模型的构建是其病理特征的人为再现，也是抗AD药物筛选和研发的重要平台，相比于体内模型，体外模型在获取和建立上更方便快捷，其高效的操作与数据获取也非常适用于最初的高通量药物筛选。Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)经蛋白酶加工而来的一种小分子多肽，根据氨基酸序列差异可分为Aβ1-42、Aβ1-40和Aβ25-35。Aβ级联假说认为，Aβ因疏水而发生异常沉积最终产生SP，引起系列下游级联反应，包括氧化应激、线粒体功能损伤、钙稳态失衡和兴奋性毒性等，进而导致神经元损伤与凋亡，加速AD的发生和发展。因此，Aβ常被用于构建AD体外模型。现有技术常通过将诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)诱导分化为神经细胞后再使用Aβ诱导构建AD模型。如Liu(LiuXQ,DengYX,DaiZ,etal.SodiumtanshinoneIIAsulfonateprotectsagainstAβ1-42-inducedcellulartoxicitybymodulatingAβ-degradingenzymesinHT22cells[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2020,151:47-55.)等采用20μmol/L的Aβ1-42诱导HT22细胞24h，胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平显著升高，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低，多数细胞胞体变圆，突触变短或消失，线粒体膜电位和ATP酶活力下降。Zhong(ZhongL,TongY,ChuanJ,etal.ProtectiveeffectofethylvanillinagainstAβ-inducedneurotoxicityinPC12cellsviathereductionofoxidativestressandapoptosis[J].Experimental&TherapeuticMedicine,2019,17(4):2666-2674.)等采用20μmol/L的Aβ1-42诱导PC12细胞，细胞内ROS和MDA水平显著升高，SOD、过氧化氢酶(CAT)和GSH-Px活性明显降低，凋亡相关蛋白Caspase-3与Bax/Bcl-2水平显著升高。但iPSC和神经元细胞培养及诱导难度较高，诱导过程较为复杂，周期长，且神经元细胞只能分化无法增殖，每次诱导数量有限，多次诱导难以满足均一性要求，严重影响了AD研究的重复性。综上所述，如何提供一种标准化和精确的建立AD体外模型的方法，操作简单，周期短，制备量大，成为AD研究领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种工程化神经细胞及其制备方法和应用，所述工程化神经细胞来源于工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞制备方法简单，且可大量制备并保存，其经过抗生素诱导、分化培养以及β-淀粉样蛋白诱导后可分化为阿尔兹海默症细胞系。为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种工程化诱导多能干细胞，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞，所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。本专利技术的工程化诱导多能干细胞中，质粒FUdeltaGW-rtTA含有调控pTet-O-Ngn2-puro和Tet-O-FUW-EGFP表达的开关，可经多西霉素诱导表达，其表达后能够调控pTet-O-Ngn2-puro和Tet-O-FUW-EGFP表达；pTet-O-Ngn2-puro表达能够启动工程化诱导多能干细胞向工程化神经细胞转变，还能使细胞具有嘌呤霉素抗性，便于快速筛选工程化神经细胞；Tet-O-FUW-EGFP能够表达绿色荧光蛋白，便于快速观察工程化神经细胞。本专利技术中，通过抗生素诱导所述工程化诱导多能干细胞即可获得工程化神经细胞，操作简单，周期短，且能够大规模制备。优选地，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。本专利技术中，使用人源诱导多能干细胞，能够更真实模拟人体内细胞。第二方面，本专利技术提供一种工程化神经细胞，所述工程化神经细胞来源于第一方面所述的工程化诱导多能干细胞。优选地，所述工程化神经细胞为将第一方面所述的工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养得到。第三方面，本专利技术提供一种具有阿尔兹海默症表型的细胞，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞来源于第二方面所述的工程化神经细胞。优选地，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞为将第二方面所述的工程化神经细胞进行处理得到。第四方面，本专利技术提供一种第三方面所述的具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞，培养获得工程化诱导多能干细胞；(2)将所述工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养，得到工程化神经细胞；(3)采用β-淀粉样蛋白处理所述工程化神经细胞，获得所述具有阿尔兹海默症表型的细胞。本专利技术中，通过病毒载体转导快速、大规模制备工程化诱导多能干细胞，随后经抗生素诱导、筛选以及分化培养得到工程化神经细胞，最后使用β-淀粉样蛋白处理所述工程化神经细胞获得具有阿尔兹海默症表型的细胞，整个制备过程操作简单，周期短，且可大规模制备，为药物开发研究提供性质均一、可重复的实验材料。优选地，步骤(1)所述导入包括：将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，利用慢病毒系统将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞。优选地，步骤(1)所述工程化诱导多能干细胞的冻存液为CryoStorCS10细胞冻存液。优选地，步骤(2)所述诱导采用的抗生素为多西霉素。优选地，步骤(2)所述筛选采用的抗生素为嘌呤霉素。优选地，步骤(2)所述分化培养采用的培养基包括第一培养基、第二培养基、第三培养基和第四培养基。优选地，所述第一培养基为含有多西霉素的KSR培养基。优选地，所述多西霉素的浓度为1～3μg/mL，包括但不限于1.2μg/mL、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化诱导多能干细胞，其特征在于，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞；/n所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程化诱导多能干细胞，其特征在于，所述工程化诱导多能干细胞为含有质粒的诱导多能干细胞；
所述质粒包括pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA。


2.根据权利要求1所述的工程化诱导多能干细胞，其特征在于，所述诱导多能干细胞包括人源诱导多能干细胞。


3.一种工程化神经细胞，其特征在于，所述工程化神经细胞来源于权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞；
优选地，所述工程化神经细胞为将权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养得到。


4.一种具有阿尔兹海默症表型的细胞，其特征在于，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞来源于权利要求1或2所述的工程化诱导多能干细胞或权利要求3所述的工程化神经细胞；
优选地，所述具有阿尔兹海默症表型的细胞为将权利要求3所述的工程化神经细胞进行定向分化培养得到。


5.一种权利要求4所述的具有阿尔兹海默症表型的细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞，培养获得工程化诱导多能干细胞；
(2)将所述工程化诱导多能干细胞进行抗生素诱导和筛选后分化培养，得到预分化状态的工程化神经细胞；将所述预分化状态的工程化神经细胞在含有神经生长因子的环境中连续培养后，得到分化成熟的工程化神经细胞；
(3)采用β-淀粉样蛋白处理所述分化成熟的工程化神经细胞，获得所述具有阿尔兹海默症表型的细胞。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述导入包括：
将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA质粒分别包装为慢病毒，利用慢病毒系统将pTet-O-Ngn2-puro、Tet-O-FUW-EGFP和FUdeltaGW-rtTA导入诱导多能干细胞。


7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述工程化诱导多能干细胞的冻存液为CryoStorCS10细胞冻存液。


8.根据权利要求5-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述诱导采用的抗生素为多西霉素；
优选地，步骤(2)所述筛选采用的抗生素为嘌呤霉素；

【专利技术属性】
技术研发人员：陈爽，洪伟，陈平，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44