一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用，涉及生物医学领域中的疾病相关基因和脑科学技术领域。该构建方法包括诱导分化TYW1基因失活的人胚胎干细胞，经发明专利技术人研究发现，TYW1基因为原发性小头畸形疾病的致病基因，参与苯丙氨酸转运RNA修饰。通过构建TYW1基因失活的人胚胎干细胞并诱导分化为类脑，能够获得原发性小头畸形疾病模型，为原发性小头畸形疾病的致病机制以及潜在的药物开发提供了一种新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物医学领域中的疾病相关基因和脑科学
，具体而言，涉及一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用。
技术介绍
原发性小头症，是指无明显诱因引起的婴儿出生后头围低于同龄同性别同种族水平。目前，对于原发性小头症尚无有效的药物治疗手段，因而发现新基因及揭示其致病机制对于原发性小头症的预测(产前诊断)和诊断以及开发潜在的治疗药物有指导意义。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种原发性小头畸形疾病模型及其构建方法和应用。本专利技术是这样实现的：第一方面，实施例提供了一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其包括诱导分化TYW1基因失活的人胚胎干细胞。第二方面，实施例提供了一种原发性小头畸形疾病模型，其由前述实施例所述的用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法构建。第三方面，实施例提供了如前述实施例所述的原发性小头畸形疾病模型在筛选用于预防或治疗原发性小头畸形疾病的药物中的应用。第四方面，实施例提供了一种用于诊断或预测原发性小头畸形疾病的生物标志物，所述生物标志物选自TYW1基因突变体。第五方面，实施例提供了一种前述实施例所述的生物标志物在用于诊断、治疗或预测原发性小头畸形疾病的试剂盒中的应用。第六方面，实施例提供了一种用于诊断、治疗或预测原发性小头畸形疾病的试剂或试剂盒，其包括用于检测待测样本基因组中TYW1基因突变的核酸组合。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术实施例提供了在筛选用于预防或治疗原发性小头畸形疾病的药物中的应用，该构建方法包括诱导分化TYW1基因失活的人胚胎干细胞，经专利技术人研究发现，TYW1基因为原发性小头畸形疾病的致病基因，参与苯丙氨酸转运RNA修饰。通过构建TYW1基因失活的人胚胎干细胞并诱导分化为类脑，能够获得原发性小头畸形疾病模型，为原发性小头畸形疾病的致病机制以及潜在的药物开发提供了一种新的途径。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1中TYW1敲除的细胞系的检测结果；图2为实施例1中TYW1敲除型类脑在不同培养阶段的形态大小比较；图3为实施例1中TYW1敲除型类脑在不同培养阶段的表面积比较；图4为实施例1中TYW1敲除型类脑在不同培养阶段的脑室带厚度比较；图5为验证例中临床发现的原发性小头畸形患儿家系图谱；图6为验证例中外显子组测序分析发现的原发性小头症患儿TYW1突变的基因位点；图7为验证例中TYW1基因在动物模型小鼠和斑马鱼大脑组织中的表达验证结果；图8为验证例中TYW1基因在斑马鱼敲除后中枢神经系统发育结果。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。首先，本专利技术实施例提供了一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其包括诱导分化TYW1基因失活的人胚胎干细胞。随着类脑技术的发展，类脑已经被用来模拟寨卡病毒引起的小头畸形、基因变异引起的小头畸形。TYW1蛋白的功能为参与苯丙氨酸转运RNA修饰，本专利技术实施例提供的TYW1突变型类脑器官有可能为转运RNA以及氨酰转运RNA合成酶缺陷导致小头畸形提供研究模型。TYW1基因失活是指TYW1基因不表达或降低表达活性，从而使TYW1蛋白降低或丧失其蛋白功能。在一些实施方式中，所述TYW1基因失活包括对人胚胎干细胞中的TYW1基因进行突变、插入或敲除。优选地，TYW1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。在一些实施方式中，所述方法包括将TYW1基因失活的人胚胎干细胞诱导分化为人源化类脑器官。需要说明的是，上述人胚胎干细胞选自现有的人胚胎干细胞细胞系，对细胞系的选择不做具体的限制。在一些实施方式中，上述人胚胎干细胞选自现有的任一人胚胎干细胞细胞系，包括但不限于H1、H7、H9、H13和H14。优选地，所述诱导分化包括：将人胚胎干细胞经胚层分化和神经外胚层分化后得到初始的神经组织进行神经上皮组织分化，以形成3D结构的人源化类脑器官。在一些实施方式中，对于人胚胎干细胞经胚层分化、神经外胚层分化和神经上皮组织分化的具体过程不作限制，过程中可以采用任何现有的胚层分化培养基和神经诱导培养基，也可以采用现有的诱导分化方法进行培养，只要是能实现将人胚胎干细胞最终诱导分化为类脑器官，则属于本申请的保护范围。优选地，所述胚层分化包括：采用培养基A培养人胚胎干细胞至出现胚层分化特征；对获得的拟胚体采用培养基B培养至拟胚体形成边界清晰的结构。需要说明的是，培养基A和培养基B均为用于诱导胚层分化的培养基。优选地，所述培养基A的组分包括：含15％～25％KOSR的DMEM/F12、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA、10～30μMY27632以及2～6ng/mlFGF；培养基B的组分包括：15％～25％KOSR的DMEM/F12、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA以及0.5％～1.5％抗生素。优选地，采用培养基A的培养时间为3～5天，采用培养基B的培养时间为1～3天。人胚胎干细胞培养基中含有高水平的bFGF用于维持其干性，没有bFGF则干细胞会自我分化。在诱导分化的培养基A中含有低水平的bFGF，B中不含bFGF，是为了逐步降低bFGF水平，在维持细胞活力的同时达到分化的目的。在分化的时候人胚胎干细胞要从克隆生长的状态被消化成单细胞，添加Y27632可以促进细胞在单细胞状态下的活力。在细胞形成拟胚体之后，可以不依赖Y27632而存活，因而在培养基A中需要Y27632，而在B中不需要Y27632。在一些实施方式中，所述神经外胚层分化包括：采用神经诱导培养基对经培养基B培养后获得的拟胚体进行培养，以获得初始的神经组织。优选地，神经诱导培养基以DMEM/F12为基础培养基，其组分为(1)或(2)：(1)0.1％～1.0％N-2(minusvitaminA)、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA、5～15μg/ml肝素、0.5～1.5μMA83-01、0.05～0.15μMLDN-193189以及0.5％～1.5％抗生素；需要说明的是，N-2是一种用于培养神经细胞的添加剂。(2)0.1％～1.0％N-2(minusvitaminA)、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其特征在于，其包括诱导分化TYW1基因失活的人胚胎干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其特征在于，其包括诱导分化TYW1基因失活的人胚胎干细胞。


2.根据权利要求1所述的用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其特征在于，所述TYW1基因失活包括对人胚胎干细胞中的TYW1基因进行突变、插入或敲除；
优选地，TYW1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.根据权利要求2所述的用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其特征在于，所述方法包括将TYW1基因失活的人胚胎干细胞诱导分化为人源化类脑器官；
优选地，人胚胎干细胞的诱导分化包括：将人胚胎干细胞经胚层分化和神经外胚层分化后得到初始的神经组织，再进行神经上皮组织分化，以形成3D结构的人源化类脑器官。


4.根据权利要求3所述的用于构建原发性小头畸形疾病模型的方法，其特征在于，所述胚层分化包括：采用培养基A培养人胚胎干细胞至出现胚层分化特征；对获得的拟胚体采用培养基B培养至拟胚体形成边界清晰的结构；
优选地，所述培养基A的组分包括：含15％～25％KOSR的DMEM/F12、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA、10～30μMY27632以及2～6ng/mlFGF；培养基B的组分包括：15％～25％KOSR的DMEM/F12、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA以及0.5％～1.5％抗生素；
优选地，所述神经外胚层分化包括：采用神经诱导培养基对经培养基B培养后获得的拟胚体进行培养，以获得初始的神经组织；
优选地，神经诱导培养基以DMEM/F12为基础培养基，其组分为(1)或(2)：
(1)0.1％～1.0％N-2(minusvitaminA)、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA、5～15μg/ml肝素、0.5～1.5μMA83-01、0.05～0.15μMLDN-193189以及0.5％～1.5％抗生素；
(2)0.1％～1.0％N-2(minusvitaminA)、0.5％～1.5％Glutmax、0.5％～1.5％非必需氨基酸NEAA、5～15μg/ml肝素、8～12μMSB431542、1～4μMDorsomorphin以及0.5％～1.5％抗生素；优选地，所述神经上皮组织分化包...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡昊，孙传波，李娜，周佩，徐开寿，
申请(专利权)人：广州市妇女儿童医疗中心广州市妇幼保健院，广州市儿童医院，广州市妇婴医院，广州市妇幼保健计划生育服务中心，
类型：发明
国别省市：广东;44