一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法技术

本发明专利技术提供一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，包括获取脑部组织：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞；对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织；将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；将所述脑部类器官进行扩大培养；将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏，本发明专利技术通过手术获取少量肿瘤组织，体外创造适合脑部细胞生长的微环境，诱导定向分化成大脑器官不同类型细胞，该方法培养的大脑类器官可长期培养和扩大培养，可用作恶性肿瘤的临床前模型，实现高通量的药物筛选，本发明专利技术同时培养出的大脑类器官可以冻存和复苏，实现长期保存，可用于建立脑部类器官样本库。

【技术实现步骤摘要】
一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法。
技术介绍
目前对于大脑发育和疾病发展的相关研究一般以动物实验为主，但是人类大脑发育结构和功能较其他哺乳动物和脊椎动物而言更复杂，参与的基因组跨度更大，因此通过研究其他动物的脑部发育特征，对人脑疾病的发病机制研究和治疗而言具有比较大的局限性。肿瘤是我国的重大公共卫生问题之一。例如恶性程度最高的脑肿瘤胶质母细胞瘤属WHOIV级，占脑部肿瘤发病率50％以上，中位生存期仅15个月。临床上已有的治疗方法，无论是手术，放疗，化疗，还是靶向药物，对该疾病疗效都非常有限。在精准医学的大背景下，肿瘤免疫治疗已取得突破性进展，靶向抗体药和免疫疗法的临床应用，彻底颠覆了恶性肿瘤的治疗理念。恶性肿瘤的精准医学离不开两大关键性技术的突破：一是高通量测序发现肿瘤相关突变，寻找药物靶点；二是临床前实验动物模型。高通量测序已广泛用于精准医学研究，包括筛选有关癌症治疗的药物靶点。胶质母细胞瘤是第一个能够应用精准医学的疾病，也是应用最好的，这得益于胶质瘤里面特殊的明确的基因突变。然而，大规模基因组表达谱分析在靶向治疗疗效预测方面的作用却十分有限，加之缺乏理想的临床前药物研究的实验动物模型，以至于严重阻碍了个性化医疗的发展。类器官三维结构体外模型，来源于三种细胞类型：体细胞，成体干细胞和多能干细胞。其中，体细胞来源的类器官培养过程中存在较多局限性，因此主要采用两种干细胞作为类器官的来源。相对于传统二维细胞培养方法，类器官模型与人体器官同源，拥有高度相似的组织学特征，能够更好的模拟人体器官的细胞结构和行为，同时长期培养仍然能保持基因表达的稳定性。类器官在实际使用过程中仍面临诸多挑战，构建类器官模型最主要的困难是确定患者来源肿瘤细胞体外培养所需的营养成分、生长因子和组织培养技术，不同类型的类器官所需条件存在很大的差异。目前，还未有完全的关于获取人体脑部组织，成功诱导多能干细胞在体外形成类器官及扩大培养的方法，脑部类器官的构建帮助我们更好的理解脑部组织器官发育过程，为临床治疗脑部疾病提供一种工具。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，达到培养脑部类器官快速、简单、方便的目的。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1：获取脑部组织；步骤2：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞，具体的说，所述脑部组织进行拟胚体制备、胚层分化得到所述脑部干细胞；步骤3：对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织，所述原始上皮组织为神经上皮组织，将所述神经上皮组织进行培养获取神经上皮细胞；步骤4：将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；步骤5：将所述脑部类器官进行扩大培养；步骤6：将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏。优选地，所述脑部组织为活跃度较高的脑部肿瘤组织，且在低温条件下进行运输。优选地，在所述拟胚体制备之前，所述脑部组织中加入细胞消化酶后获取脑部细胞于六孔板内，所述所述拟胚体的制备过程具体包括：首先，所述六孔板内加入AdvantageDMEMF-12培养基与所述脑部细胞混合，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述AdvantageDMEMF-12并用缓冲液溶液清洗残留培养基；其次,在所述六孔板内加入蛋白水解酶并置于所述二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述蛋白水解酶并加入低bFGF-hESC培养基后得到脑部干细胞；最后，在所述脑部干细胞溶液中加入含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基重新培养，将所述脑部干细胞转移至96孔U形底板并置于所述二氧化碳培养箱中培养。优选地，所述胚层分化的具体过程包括：首先,更换所述96孔U形底板中的所述含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基，并用体视显微镜测量所述脑部干细胞直径，其次，当所述脑部干细胞的直径大于350μm，将所述96孔U形底板中的所述含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基更换为不含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基进行培养所述脑部干细胞，直到所述脑部干细胞的直径大于500μm。优选地，关于步骤3，获取所述神经上皮细胞具体包括：将直径大于500μm的所述脑部干细胞转移至24孔板内，并添加神经诱导培养基进行培养，之后去除所述神经诱导培养基，提取所述神经上皮细胞。优选地，关于步骤4，获取所述脑部类器官具体过程包括：首先，选取封口膜，将所述封口膜剪成正方形，按入形成凹槽，所述正方形封口膜置于培养皿中；其次，将所述神经上皮细胞与所述基质胶混合后置于所述凹槽内进行包埋，并在所述二氧化碳培养箱中进行培养；最后，在所述培养皿中加入脑类器官分化培养基，并置于所述二氧化碳培养箱中进行培养。优选地，关于步骤5，所述脑部类器官扩大培养具体步骤包括：首先，将所述培养皿中的所述脑部类器官转移至旋转生物反应器中；其次，在所述旋转生物反应器中加入所述脑类器官分化培养基；最后，将所述旋转生物反应器安装于所述二氧化碳培养箱中进行培养。进一步说明，所述旋转生物反应器在安装于所述二氧化碳培养箱之前需使用酒精喷洒擦拭后，且所述旋转生物反应器安装于搅拌板上。优选地，所述脑部类器官进行冻存具体包括：首先，收集单个脑部细胞类器官，加入细胞冻存液进行重悬后放入冻存管中；其次，将所述冻存管安装于所述程序降温盒中，进行冷冻；最后，将所述冻存管至于液氮中。优选地，所述脑部类器官复苏具体步骤包括：提取所述液氮中的所述冻存管并置于水浴箱中；收集所述单个脑部细胞类器官，进行包埋，加入脑类器官分化培养基后置于所述二氧化碳培养箱中培养。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果：本专利技术通过手术获取少量肿瘤组织，体外创造适合脑部细胞生长的微环境，诱导定向分化成大脑器官不同类型细胞，该方法培养的大脑类器官可长期培养和扩大培养，可用作恶性肿瘤的临床前模型，实现高通量的药物筛选。本专利技术同时培养出的大脑类器官可以冻存和复苏，实现长期保存，可用于建立脑部类器官样本库。本专利技术培养方法能够以简单的方案获取所需要的类器官，培养速度快。附图说明图1为本专利技术一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法的细胞类器官培养五天的示意图；图2为本专利技术一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法的细胞类器官培养十四天的示意图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特征细节仅仅是为了帮助全面理解本专利技术的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本专利技术的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，省略了对已本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n步骤1：获取脑部组织；/n步骤2：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞，具体的说，所述脑部组织进行拟胚体制备、胚层分化得到所述脑部干细胞；/n步骤3：对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织，所述原始上皮组织为神经上皮组织，将所述神经上皮组织进行培养获取神经上皮细胞；/n步骤4：将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；/n步骤5：将所述脑部类器官进行扩大培养；/n步骤6：将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1：获取脑部组织；
步骤2：培养所述脑部组织来获取脑部干细胞，具体的说，所述脑部组织进行拟胚体制备、胚层分化得到所述脑部干细胞；
步骤3：对所述脑部干细胞进行诱导，形成原始上皮组织，所述原始上皮组织为神经上皮组织，将所述神经上皮组织进行培养获取神经上皮细胞；
步骤4：将所述神经上皮细胞转移至基质胶混合并进行培养获取脑部类器官；
步骤5：将所述脑部类器官进行扩大培养；
步骤6：将所述脑部类器官进行冻存建库及复苏。


2.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述脑部组织为活跃度较高的脑部肿瘤组织，且在低温条件下进行运输。


3.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：在所述拟胚体制备之前，所述脑部组织中加入细胞消化酶后获取脑部细胞于六孔板内，所述所述拟胚体的制备过程具体包括：
首先，所述六孔板内加入AdvantageDMEMF-12培养基与所述脑部细胞混合，并置于二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述AdvantageDMEMF-12并用缓冲液溶液清洗残留培养基；
其次,在所述六孔板内加入蛋白水解酶并置于所述二氧化碳培养箱中培养，培养后去除所述蛋白水解酶并加入低bFGF-hESC培养基后得到脑部干细胞；
最后，在所述脑部干细胞溶液中加入含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基重新培养，将所述脑部干细胞转移至96孔U形底板并置于所述二氧化碳培养箱中培养。


4.根据权利要求1所述的一种利用多能干细胞生成脑部类器官的方法，其特征在于：所述胚层分化的具体过程包括：
首先,更换所述96孔U形底板中的所述含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基，并用体视显微镜测量所述脑部干细胞直径，
其次，当所述脑部干细胞的直径大于350μm，将所述96孔U形底板中的所述含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基更换为不含ROCK抑制剂的低bFGF-hESC培养基进行培养所述脑部干细胞，直到...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺云彦，
申请(专利权)人：杭州联众医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33