一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其包括，获取孕鼠大脑皮质和海马组织；用DMEM/F12基础培养液制备所述海马组织的单细胞悬液；用神经干细胞培养液重悬，接种、培养形成细胞球；消化所述细胞球，终止后过滤得单细胞悬液，接种后传代培养，收集细胞球；消化收集到的所述细胞球，终止后用神经干细胞培养液重悬，接种，让悬浮的单细胞贴壁，继续用神经干细胞培养液培养；所述神经干细胞培养液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF组成。本方法可明显提高体外培养的大鼠海马RGCs的纯度，可达97％左右。

【技术实现步骤摘要】
一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法
技术介绍
目前已证实，放射状胶质细胞(Radialgliacells,RGCs)是一类形态、生物学特性和功能上独特的细胞，为神经胶质细胞的一种，具有典型的细而长的突起，为双极性形态。在胚胎时期是一类干细胞，其放射状的突起可以担当新生未成熟神经元的“脚手架(scaffolding)”,引导神经元长距离迁移，到达某些特定区域并分化为成熟神经细胞,与局部区域建立突触联接；还具有NSCs功能，作为神经前体细胞，通过不对称分裂与对称分裂产生神经元或神经胶质细胞。RGCs呈现出神经上皮细胞和胶质细胞的特征，能表达干/祖细胞的标记物，比如Nestin、Sox2，同时也能表达一些星形胶质细胞标记物，如脑脂结合蛋白(brainlipidbindingprotein,BLBP)、Vimentin、RC1、RC2、C腱糖蛋白(tenascin-C,TN-C)、谷氨酸盐转运蛋白(glutamatetransporter,GLAST)、谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)、S100等。目前关于RGCs的分离培养，有学者应用具有2μm槽的聚甲基丙烯酸甲酯(ln2PMMA)支架，模拟胚胎神经干细胞池的生物微环境，体外诱导RGCs培养，然而获得的RGCs仅达到80％。用此纯度不高的细胞作为研究对象，对后续的实验研究带来诸多干扰因素，导致实验结果不稳定。因此如何提高体外培养的大鼠海马胚胎RGCs的纯度成为关键问题。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。本专利技术的主要目的在于提供一种体外纯化培养大鼠海马RGCs的方法。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其包括，获取孕鼠大脑皮质和海马组织；用DMEM/F12基础培养液制备所述海马组织的单细胞悬液；用神经干细胞培养液重悬，接种、培养形成细胞球；消化所述细胞球，终止后过滤得单细胞悬液，接种后传代培养，收集细胞球；消化收集到的所述细胞球，终止后用神经干细胞培养液重悬，接种，让悬浮的单细胞贴壁，继续用神经干细胞培养液培养。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述神经干细胞培养液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF组成。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述接种，其接种的细胞密度为1×104个/ml～1×105个/ml。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述接种、培养形成细胞球，其接种的细胞密度为1×105个/ml；所述接种后传代培养，其其接种的细胞密度为1×104个/ml。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述消化用的酶包括Accutase酶、胰酶中的一种或几种。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述消化所述细胞球，其为使用Accutase酶进行；所述消化收集到的所述细胞球，其为使用胰酶进行。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述终止，其为用含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述传代，其为传代3次以上。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述培养，其为培养2～7天。作为本专利技术所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法的优选方案，其中：所述培养形成细胞球，其为培养5～7d；所述接种后传代培养，其为培养5～7d；所述继续用神经干细胞培养液培养，其为培养3天以上。本专利技术的有益效果：本方法可明显提高体外培养的大鼠海马RGCs的纯度，可达97％左右。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为原代悬浮培养约5d后，可见培养瓶内新形成的细胞球；图2为传代3次后，将球消化制成单细胞悬液，接种于含有预涂多聚赖氨酸24孔培养板内，让悬浮的单细胞进行贴壁培养，3d后明视野下可见细胞长出突起，呈现双极特征，形成RGCs；图3为体外通过贴壁法纯化培养大鼠海马RGCs的免疫荧光检测，海马RGCs共表达神经干细胞标记物Nestin、Sox2和胶质细胞标记物GFAP、BLBP和Vimentin(C-F)，Scalebars＝50μm；图4为各双标记细胞与总细胞百分比的统计图(G)，原代悬浮培养约5d后，可见培养瓶内新形成的细胞球。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本专利技术的技术方案如下：1.取孕14dSD大鼠1只，用复合麻醉剂Chlorpent0.4ml/100g经腹腔麻醉后，无菌条件下打开腹腔，取出胎鼠(7-8只)，置于含有预冷DMEM/F12基础培养液的培养皿中；2.在超净台上用眼科剪剪开胎鼠头部皮肤和头骨后，取出全脑组织，掀开大脑皮质，使用眼科镊分离分离并取出海马组织，剔除血管、脑膜和脉络膜等结缔组织，经DMEM/F12基础培养液轻轻洗涤后，将皮质组织剪碎成1mm3大小的组织块；3.将海马组织块移至盛有DMEM/F12基础培养液的离心管内，机械反复轻轻吹打成单细胞悬液，用无菌200目尼龙网过滤，收集过滤后的细胞悬液；用DMEM/F12基础培养液清洗，1000r/min离心10min，吸去上清，重复一次。...

【技术保护点】
1.一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其特征在于：包括，/n获取孕鼠大脑皮质和海马组织；/n用DMEM/F12基础培养液制备所述海马组织的单细胞悬液；/n用神经干细胞培养液重悬，接种、培养形成细胞球；/n消化所述细胞球，终止后过滤得单细胞悬液，接种后传代培养，收集细胞球；/n消化收集到的所述细胞球，终止后用神经干细胞培养液重悬，接种，让悬浮的单细胞贴壁，继续用神经干细胞培养液培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其特征在于：包括，
获取孕鼠大脑皮质和海马组织；
用DMEM/F12基础培养液制备所述海马组织的单细胞悬液；
用神经干细胞培养液重悬，接种、培养形成细胞球；
消化所述细胞球，终止后过滤得单细胞悬液，接种后传代培养，收集细胞球；
消化收集到的所述细胞球，终止后用神经干细胞培养液重悬，接种，让悬浮的单细胞贴壁，继续用神经干细胞培养液培养。


2.如权利要求1所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其特征在于：所述神经干细胞培养液由DMEM/F12、2％B27、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF组成。


3.如权利要求1或2所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其特征在于：所述接种，其接种的细胞密度为1×104个/ml～1×105个/ml。


4.如权利要求3所述的体外纯化培养大鼠胚胎海马放射状胶质细胞的方法，其特征在于：所述接种、培养形成细胞球，其接种的细胞密度为1×105个/ml；所述接种后传代培养，其其接种的细胞密度为1×104个/ml。

【专利技术属性】
技术研发人员：邹琳清，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32