一种角膜内皮细胞的诱导方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域。本发明专利技术提供了一种角膜内皮细胞的诱导方法，包括如下步骤(1)将诱导性多能干细胞依次在mTeSR1培养基、双重Smad抑制剂培养基和第一角膜内皮细胞培养基中培养，得到分化的诱导性多能干细胞；(2)将分化的诱导性多能干细胞消化，用第二角膜内皮细胞培养基吹散细胞得到细胞悬液；(3)将细胞悬液用混合培养基培养，得到角膜内皮细胞。本发明专利技术的诱导方法可在较短时间内获取大量，高纯度的角膜内皮细胞，获得的角膜内皮细胞可在体外传代至少4次，有效解决人角膜供体数量受限和原代人角膜内皮细胞在体外扩增能力有限的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种角膜内皮细胞的诱导方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种角膜内皮细胞的诱导方法。
技术介绍
角膜由三个细胞层组成，分别是上皮层、基质层和内皮层，角膜内皮是位于角膜内侧的4微米厚的单层膜，负责通过使基质脱水来维持角膜透明性。人角膜内皮细胞不能在体内再生，且角膜内皮细胞的密度随着年龄的增长而逐渐降低，从新生儿的约4000/mm2降低至老年人的约2300/mm2。当角膜内皮细胞密度达到临界低水平时，基质层会水肿，引起疼痛并产生角膜失明。完全移植所有角膜层以及仅选择性替换受损的内皮层，还有新的改进方法，如Descemet膜内皮角膜移植术和Descemet膜内皮转移是角膜内皮功能障碍的主要手术治疗选择。近年来，原代人角膜内皮细胞的培养虽然取得了新进展；然而，人角膜供体数量十分有限，且原代来源的人角膜内皮细胞在体外扩增能力有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种角膜内皮细胞的诱导方法，解决人角膜供体数量有限和原代来源的人角膜内皮细胞在体外扩增能力有限的问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将诱导性多能干细胞依次在mTeSR1培养基、双重Smad抑制剂培养基和第一角膜内皮细胞培养基中培养，得到分化的诱导性多能干细胞；/n(2)将分化的诱导性多能干细胞消化，用第二角膜内皮细胞培养基吹散细胞得到细胞悬液；/n(3)将细胞悬液用混合培养基培养，得到角膜内皮细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将诱导性多能干细胞依次在mTeSR1培养基、双重Smad抑制剂培养基和第一角膜内皮细胞培养基中培养，得到分化的诱导性多能干细胞；
(2)将分化的诱导性多能干细胞消化，用第二角膜内皮细胞培养基吹散细胞得到细胞悬液；
(3)将细胞悬液用混合培养基培养，得到角膜内皮细胞。


2.根据权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于，所述诱导性多能干细胞在mTeSR1培养基中培养的时间为3～5天。


3.根据权利要求2所述的一种角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于，所述诱导性多能干细胞在双重Smad抑制剂培养基中培养的时间为2～4天，所述双重Smad抑制剂培养基的制备方法为：按DMEM/F12培养基68.9～84.1份、KSR15～30份、NEAA0.9～1.1份的体积比配制基础培养基，在基础培养基中加入人重组Noggin、SB431542、谷氨酰胺、β-巯基乙醇和bFGF得到含有300～500ng/mL人重组Noggin、9～11μMSB431542、0.9～1.1mM谷氨酰胺、0.09～0.11mMβ-巯基乙醇、5～20ng/mLbFGF的基础培养基，即为双重Smad抑制剂培养基。


4.根据权利要求3所述的一种角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于，所述诱导性多能干细胞在第一角膜内皮细胞培养基中培养的时间为1～3天，所述第一角膜内皮细胞培养基的制备方法为：按DMEM/F12培养基68.9～84.1份、KSR15～30份、NEAA0.9～1.1份的体积比配制基础培养基，在基础培养基中加入B27补充剂、PDGF-BB、DKK-2、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和bFGF得到含有0.09～0.11×B27补充剂、9～11ng/mLPDGF-BB、9～11ng/mLDKK-2、0.8～1.2mML-谷氨酰胺、0...

【专利技术属性】
技术研发人员：边黎颖，
申请(专利权)人：江苏艾尔康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32