用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法技术

本发明专利技术公开了一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法，该方法包括步骤：1)从脑出血早产儿的侧脑室收集血性脑脊液；2)离心收集细胞；3)用神经干细胞培养基重悬细胞并维持培养；4)3

【技术实现步骤摘要】
用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法


[0001]本专利技术涉及神经干细胞培养方法，尤其涉及一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基膜干细胞培养方法。

技术介绍

[0002]新生儿脑出血与成人脑出血不一样，所有新生儿脑出血都是生发基质层这个部位引起的。新生儿脑生发基质(Germinal Matrix，GM)富含新生血管以及刚完成迁移的胶质细胞，而早产儿GM血管缺乏弹力蛋白以及粘膜肌层，在血管压力变化情况下极易破裂出血。生发基质出血(Germinal Matrix Hemorrhage，GMH)是新生儿最危重的神经系统疾病之一，发病率约为3.5
‰
。GMH患儿后遗症较多，包括偏瘫、失语、昏迷和发育障碍等，大多数患儿会发展成我们熟知的脑瘫这种疾病。
[0003]用神经干细胞治疗脑出血后遗症是现今的热点研究领域，近年来国内外神经干细胞移植的动物及临床实验证实其对脑损伤有一定的疗效，为神经干细胞移植治疗脑出血后遗症提供了科学依据，但神经干细胞的来源缺乏及移植后免疫系统排斥等问题限制了其治疗脑损伤的进一步研究。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于开发一种来源可靠、易体外培养、脑内易存活的自体神经干细胞及其可操作性强的培养方法。

技术实现思路

[0005]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术首先提供了一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法，该方法包括步骤：
[0006]1)从脑出血早产儿的侧脑室收集血性脑脊液；
[0007]2)离心收集细胞；
[0008]3)用神经干细胞培养基重悬细胞并维持培养；
[0009]4)3
‑
5天半量换液，6
‑
8天后消化细胞并进行传代培养；
[0010]5)传代至3
‑
5代后，收集所述生发基质干细胞。
[0011]进一步，步骤1)可具体包括：在定位装置(如3D导航或术中超声)引导下开通侧脑室通道，将内镜灌洗系统的内镜套筒插入通道，一边灌洗血肿一边收集血性脑脊液；其中灌洗液优选为37℃的林格氏(Ringer)液。优选地，灌洗液的用量为1500
‑
2000mL。
[0012]在一个具体的实施方案中，灌洗通道有一个进水口和一个出水口，灌洗速度调整合适，保持颅内压力稳定，一边从进水口灌洗一边从出水口收集血性脑脊液。
[0013]优选地，步骤1)在检测囟门张力的情况下进行，张力较高时轻微负压抽吸，张力下降后用灌洗液连续灌洗并收集灌洗液。
[0014]进一步，步骤2)中离心收集细胞的离心速度优选为350
‑
400g，离心时间优选为8
‑
12分钟。
[0015]进一步，步骤3)中所述神经干细胞培养基的基础培养基为Neurobasal，其中添加
有以下成分：EGF(表皮生长因)、bFGF(碱性成细胞生长因子)、LIF(白血病抑制因子)、肝素、B27添加剂、N2添加剂、非必需氨基酸、聚
‑
L
‑
鸟氨酸和人胎盘层粘连蛋白。
[0016]优选地，所述非必需氨基酸包括：甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
‑
天冬酰胺、L
‑
天冬氨酸、谷氨酸、L
‑
脯氨酸、L
‑
丝氨酸。
[0017]优选地，各成分添加后的含量分别为：
[0018][0019]优选地，B27添加剂为Gibco的50
×
溶液，根据其说明书所述添加溶液与培养液的体积比为2％。
[0020]优选地，N2添加剂为Gibco的100
×
溶液，根据其说明书所述添加溶液与培养液的体积比1％。
[0021]优选地，所述非必需氨基酸为Gibco的或Sigma
‑
Aldrich的MEM非必需氨基酸。
[0022]进一步，所述神经干细胞培养基内还添加有青霉素和/或链霉素，青霉素的含量优选为80
‑
120IU/mL，链霉素的含量优选为80
‑
120μg/mL。
[0023]优选地，步骤3)中细胞的接种密度为1
×
104‑1×
105个/mL。
[0024]进一步，步骤3)中所述维持培养是：放置在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。
[0025]进一步，步骤4)所述的消化细胞并进行传代的方法为：当70％以上，优选80％以上的生发基质干细胞的细胞球生长至200μm至400μm，优选200μm至350μm时，消化所述生发基质干细胞并接种至低吸附培养瓶中进行培养。其中，细胞接种密度优选为1
×
105‑3×
105个/mL，培养条件为37℃、5％CO2。
[0026]优选地，步骤4)所述的消化是通过Accutase酶和木瓜蛋白酶的混合消化液进行的。
[0027]在具体的实施方案中，将培养瓶中的悬浮细胞球及培养液吸入离心管中，以1000转/分钟的速度离心5分钟后弃去上清，将沉淀用体积比为1:1的混合Accutase酶溶液(Gibco)和10单位/mL木瓜蛋白酶溶液消化5分钟，轻轻吹打，再以1000转/分钟的速度离心5分钟后弃去上清，加入新鲜的神经干细胞培养基，混匀后转入低吸附培养瓶中进行培养。
[0028]优选地，步骤3)和4)的整个培养过程使用3D极低吸附培养瓶进行培养。
[0029]进一步，步骤3)和4)的整个培养过程中每3
‑
5天，优选每4天，进行半量换液；每6
‑
8天，优选每7天，对所述生发基质干细胞进行传代。
[0030]进一步，步骤5)还包括将生发基质干细胞冻存的步骤，该冻存的步骤具体为：收集原培养瓶中含生发基质干细胞的培养液，离心，弃去上清，用冻存液重悬细胞后，装入冻存管，逐步降温，最后置于液氮内冻存。
[0031]优选地，所述冻存液为含体积百分比8％
‑
12％的DMSO和质量百分比1％
‑
3％的羟
乙基淀粉的Neurobasal培养基。
[0032]进一步，根据实际使用的需要，所述自体生发基质干细胞培养方法还包括将自体生发基质干细胞诱导分化为神经元或神经胶质细胞的步骤。
[0033]所述诱导为神经元的方法为：将传代至3
‑
5代(优选为第3代)的生发基质干细胞用Accutase酶和木瓜蛋白酶的混合消化液进行消化后，接种至多聚
‑
L
‑
赖氨酸和层粘连蛋白双包被的培养容器中，并用神经元分化培养基进行诱导培养6
‑
8天；其中所述神经元分化培养基为添加有0.4
‑
0.6μM全反式维甲酸、8
‑
12ng/mL重组人BDNF(脑源性神经生长因子)和1
‑
5ng/L TG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，包括步骤：1)从脑出血早产儿的侧脑室收集血性脑脊液；2)离心收集细胞；3)用神经干细胞培养基重悬细胞并维持培养；4)3
‑
5天半量换液，6
‑
8天后消化细胞并进行传代培养；5)传代至3
‑
5代后，收集所述生发基质干细胞。2.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤1)具体包括：定位装置引导下开通侧脑室通道，将内镜灌洗系统的内镜套筒插入通道，一边灌洗血肿一边收集血性脑脊液。3.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤3)中所述神经干细胞培养基的基础培养基为Neurobasal，其中添加有以下成分：EGF、bFGF、LIF、肝素、B27添加剂、N2添加剂、非必需氨基酸、聚
‑
L
‑
鸟氨酸和人胎盘层粘连蛋白。4.如权利要求3所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，所述非必需氨基酸包括：甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
‑
天冬酰胺、L
‑
天冬氨酸、谷氨酸、L
‑
脯氨酸、L
‑
丝氨酸。5.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤4)所述的消化细胞并进行传代的方法为：当70％以上的生发基质干细胞的细胞球生长至200μm至400μm时，消化所述生发基质干细胞并接种至低吸附培养瓶中进行培养。6.如权利要求1所述的自...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金虎，
申请(专利权)人：浙江以和细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：