诱导型神经干细胞培养液及制备方法技术

本发明专利技术提供诱导型神经干细胞培养液，所述培养液由：体积比为1:0.8～1.2的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基Neurobasal medium，以及腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L

【技术实现步骤摘要】
诱导型神经干细胞培养液及制备方法


[0001]本专利技术涉及一种诱导型神经干细胞培养液及制备方法，属于


技术介绍

[0002]神经干细胞(NSCs)是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，包括神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。而利用转分化技术可实现NSCs在体外大量繁殖、自我更新及多向分化。而从人体(如中枢神经系统)分离得到的少量NSCs通过增殖达到一定浓度和标准移植入人体后，在体内微环境的影响下，可分化为相应的NSCs，使受损的神经的功能得到修复，而且植入的NSCs可以向神经病变部位迁移和聚焦，促进宿主神经系统受损功能的恢复。这些使得神经系统损伤性疾病的治疗有了新的策略方向，NSCs的研究已成为治疗神经退行性疾病和中枢神经损伤的热点。另外，NSCs也成为了生物医学工程以及体外模型研究中所必须的种子细胞。
[0003]因此有必要研发避免道德争议的基于外周血单核细胞(PBMC)培养神经干细胞的定向分化培养液及制备方法的技术方案。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种诱导型神经干细胞培养液及制备方法，以解决避免道德争议的基于外周血单核细胞(PBMC)培养神经干细胞的定向分化培养液及制备方法的技术方案的研发。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供诱导型神经干细胞培养液，其特征在于，所述培养液由：体积比为1:0.8～1.2的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基Neurobasal medium，以及腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L
‑
抗坏血酸、L
‑
谷氨酰胺衍生物、ALK抑制剂、神经诱导化合物、生长因子和视黄酸组成；所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3～8μmol/L，所述血清替代物浓度为3～9mmol/L，所述L
‑
抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L
‑
谷氨酰胺衍生物浓度为5～15mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为1～3mmol/L，所述神经诱导化合物的浓度为15～18μM，所述生长因子的浓度为30～50ng/ml，所述视黄酸浓度范围为0.05～0.15mmol/L。
[0006]作为一种较佳的实施例，所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素；所述L
‑
谷氨酰胺衍生物为GlutaMAX
‑
I二肽；所述血清替代物为N2和/或B27；所述ALK抑制剂为LDK378和/或GSK1838705A；所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF。
[0007]作为一种较佳的实施例，所述DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基的体积比为1:1，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3～8μmol/L，所述血清替代物浓度为3～9mmol/L，所述L
‑
抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L
‑
谷氨酰胺衍生物浓度为5～15mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为1～3mmol/L，所述神经诱导化合物的浓度为15～18μM，所述生长因子的浓度为30～50ng/ml，所述视黄酸浓度范围为0.05～0.15mmol/L。
[0008]作为一种较佳的实施例，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3～8μmol/L，所述血清
替代物浓度为5～7mmol/L，所述L
‑
抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L
‑
谷氨酰胺衍生物浓度为5～15mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为1～3mmol/L，所述神经诱导化合物的浓度为15μM，所述生长因子的浓度为30～40ng/ml，所述视黄酸浓度范围为0.05～0.15mmol/L。
[0009]作为一种较佳的实施例，所述神经诱导化合物包括PD98059和JW55。
[0010]作为一种较佳的实施例，所述PD98059在诱导型神经干细胞培养液中的终浓度为8～13μM，所述JW55在诱导型神经干细胞培养液中的终浓度为5～10μM。
[0011]本专利技术还提出诱导型神经干细胞培养液的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤SS1：制备混合培养基；步骤SS2：向步骤SS1制备的混合培养基中加入腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L
‑
抗坏血酸、L
‑
谷氨酰胺衍生物、ALK抑制剂、神经诱导化合物、生长因子和视黄酸，形成诱导型神经干细胞培养基液；步骤SS3：向步骤SS2制备的诱导型神经干细胞培养基液加入生长因子制备完成诱导型神经干细胞培养液。
[0012]作为一种较佳的实施例，所述步骤SS1具体包括： 按体积比为1:0.8～1.2的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基Neurobasal medium制备混合培养基。
[0013]作为一种较佳的实施例，所述步骤SS2具体包括：向步骤SS1制备的混合培养基中加入3～8μmol/L的腺苷酸环化酶激活剂、3～9mmol/L的血清替代物、0.06～0.15mmol/L 的L
‑
抗坏血酸、5～15mmol/L 的L
‑
谷氨酰胺衍生物、1～3mmol/L 的ALK抑制剂、15～18μM的神经诱导化合物、30～50ng/ml的生长因子和0.05～0.15mmol/L的视黄酸，形成诱导型神经干细胞培养基液。
[0014]作为一种较佳的实施例，所述步骤SS3具体包括：向步骤SS2制备的诱导型神经干细胞培养基液加入30～50ng/ml的植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF制备完成诱导型神经干细胞培养液。
[0015]本专利技术所达到的有益效果：第一，使用本专利技术的诱导型神经干细胞培养液，经过制备方法，可解决避免道德争议的基于外周血单核细胞(PBMC)培养神经干细胞的定向分化得到纯度较高的神经干细胞；第二，同时使用小分子抑制剂加入到诱导型神经干细胞培养液中进行诱导细胞定向分化为神经干细胞，且分化的神经干细胞具有自我更新、分化为神经元细胞的功能和电生理功能；第三，本专利技术的外周血单核细胞可取自患者血液，且无数量限制，可避免道德争议；第四，与现有的动物模型相比，本专利技术培养得到的神经干细胞提供了最接近人体的体外细胞模型，降低了或无免疫排斥反应，本专利技术的制备方法使用非动物源性的生长因子来替换传统的动物源性的生长因子，从而制备出无血清无动物源性的诱导型神经干细胞培养液的制备方法，解决了动物源性培养方法制约神经干细胞在临床上的使用问题。
具体实施方式
[0016]下面对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。
[0017]实施例1：本专利技术提供诱导型神经干细胞培养液，:所述培养液由：体积比为1:0.8
～1.2的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基Neurobasal medium，以及腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L
‑
抗坏血酸、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.诱导型神经干细胞培养液，其特征在于，所述培养液由：体积比为1:0.8～1.2的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基Neurobasal medium，以及腺苷酸环化酶激活剂、血清替代物、L
‑
抗坏血酸、L
‑
谷氨酰胺衍生物、ALK抑制剂、神经诱导化合物、生长因子和视黄酸组成；所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3～8μmol/L，所述血清替代物浓度为3～9mmol/L，所述L
‑
抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L
‑
谷氨酰胺衍生物浓度为5～15mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为1～3mmol/L，所述神经诱导化合物的浓度为15～18μM，所述生长因子的浓度为30～50ng/ml，所述视黄酸浓度范围为0.05～0.15mmol/L。2.根据权利要求1所述的诱导型神经干细胞培养液，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素；所述L
‑
谷氨酰胺衍生物为GlutaMAX
‑
I二肽；所述血清替代物为N2和/或B27；所述ALK抑制剂为LDK378和/或GSK1838705A；所述生长因子为植物源重组人碱性生长因子OsrbFGF。3.根据权利要求1所述的诱导型神经干细胞培养液，其特征在于，所述DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基的体积比为1:1，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3～8μmol/L，所述血清替代物浓度为3～9mmol/L，所述L
‑
抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L
‑
谷氨酰胺衍生物浓度为5～15mmol/L，所述ALK抑制剂浓度为1～3mmol/L，所述神经诱导化合物的浓度为15～18μM，所述生长因子的浓度为30～50ng/ml，所述视黄酸浓度范围为0.05～0.15mmol/L。4.根据权利要求3所述的诱导型神经干细胞培养液，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为3～8μmol/L，所述血清替代物浓度为5～7mmol/L，所述L
‑
抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L
‑
谷氨酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凌鸿，王卫星，都兴洋，
申请(专利权)人：赛尔生命科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：