一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓-GelMA水凝胶复合材料支架制造技术

本发明专利技术提供一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓

【技术实现步骤摘要】
一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架


[0001]本专利技术涉及再生医学与组织工程
，尤其涉及一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架。

技术介绍

[0002]脊髓损伤（SCI）的发病率在全球范围内有所增加。SCI 导致大量神经细胞死亡，导致运动和感觉功能障碍。由于脊髓几乎没有再生能力，成熟的神经细胞在脊髓损伤后不能分裂和增殖以替代丢失的细胞,而且受伤部位的神经胶质细胞会被激活，大量增殖形成胶质瘢痕，受损细胞的髓鞘会产生大量抑制轴突生长的因子，如：Nogo、髓鞘相关蛋白(MAG)、少突胶质细胞
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髓鞘糖蛋白(OMgp)等。这些内外因形成了抑制神经再生的微环境。
[0003]随着干细胞研究的发展，干细胞移植有望促进脊髓损伤后的解剖修复和功能恢复。神经干细胞 (NSC) 是神经系统损伤和神经退行性疾病最有前景的治疗策略。 NSCs具有一定的分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，可以替代坏死细胞，促进脊髓结构和功能的修复。然而，移植的神经干细胞面临一系列问题：受损区域会导致广泛的细胞死亡、神经元分化不良和神经干细胞从损伤部位渗漏。
[0004]外源性工程支架在体内神经再生和功能恢复方面具有巨大潜力，并且还可以克服在受损脊髓中移植干细胞所面临的许多问题。组织工程支架可以填充病变腔，改善受损区域的微环境，促进内源性和外源性细胞的增殖、迁移和分化。理想情况下，组织工程支架应具有良好的生物相容性、无毒、促进神经再生。在这里，我们选择了一种天然生物材料脱细胞脊髓细胞外基质。与合成材料相比，脱细胞脊髓具有天然的三维网络结构，含有运动神经元存活和生长所必需的层粘连蛋白和蛋白多糖。其细胞成分被去除，大大降低了免疫原性。脱细胞细胞外基质（dECM）也可作为载体携带药物、干细胞和营养因子，促进损伤部位神经再生。因此在组织工程和再生医学中得到了广泛的应用。然而，脱细胞脊髓通常不能完全匹配损伤部位。研究人员发现，脱细胞脊髓可以用酶消化，得到脱细胞脊髓溶液，一种热凝胶水凝胶，可以注射到损伤部位，与损伤部位完全贴合。体外细胞实验结果表明，脱细胞脊髓支架可促进NSCs的粘附、增殖和分化。然而，脱细胞脊髓支架的结构稳定性和力学性能较差，降解速度快。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术中脱细胞脊髓支架的结构稳定性和力学性能交叉，降解速度快的技术问题，引入了由甲基丙烯酸酐和明胶制成的甲基丙烯酸酐明胶(GelMA)。它是一种光敏生物水凝胶材料。 GelMA 的双键结构已被修改为可交联且易于改变其机械性能。 GelMA 水凝胶已被证明具有低细胞毒性和高细胞活力。与天然生物材料相比，GelMA 水凝胶可能缺乏足够的生物活性，修复效果有限。因此，我们将 GelMA 水凝胶与脱细胞脊髓溶液混合作为一种新的复合支架用于研究。两者的结合延长了光敏分子的分子
链，可以获得含水量高、弹性柔软的特性，更适合细胞生长。体外实验表明，该复合支架具有良好的生物相容性，支持细胞增殖和分化。这为制定有效的移植策略提供了机会，为促进新神经元网络和功能连接的形成提供了新思路。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架，由成年猪脱细胞脊髓制备而成的脱细胞基质液和GelMA水凝胶组成。
[0007]优选的，所述脱细胞基质液与所述GelMA水凝胶的混合比例为1:9或3:7。
[0008]优选的，所述GelMA的浓度为5%。
[0009]本申请还提供了一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架的制备方法，包含以下步骤：S1：成年猪脱细胞脊髓制备；S2：GelMA水凝胶的制备；S3：脱细胞脊髓与GelMA混合支架的制备。
[0010]优选的，所述S3具体步骤为：将溶解的脱细胞溶液和5%的GelMA水凝胶按一定比例混合，在紫外光照下进行光交联，即得到脱细胞支架溶液
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GelMA水凝胶复合材料。
[0011]优选的，所述S3中 GelMA浓度为5%，并且，所述脱细胞基质液与所述GelMA水凝胶的混合比例为1:9或3:7。
[0012]根据权利要求5所述的促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架的制备方法，其特征在于：所述S3中紫外光波长为405nm，光照时间为18秒。
[0013]本申请还提供了一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架的验证方法：包含以下步骤：A1：神经干细胞的分离与培养；A2：活死细胞染色；A3：鬼笔环肽染色；A4：EdU增殖实验；A5：NSCs分化实验。
[0014]本申请提供的一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架，克服目前SCI之后NSCs移植难以固定，损伤处抑制性微环境导致细胞死亡等技术和方法的不足，应用我们构建的复合支架可以有效规避这一问题，并且复合支架形成的微环境有助于调控NSCs的行为。本申请通过构建一种脱细胞脊髓
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GelMA复合支架，为NSCs提供良好的微环境，促进NSCs的存活和迁移，调控NSCs增殖和分化的行为。脱细胞脊髓保留了神经元生长所需的透明质酸，层粘连蛋白以及一些生长因子，为神经干细胞提供养分，GelMA水凝胶弥补了脱细胞脊髓不能长期稳定的缺点，为神经干细胞提供长期稳定的生长环境。
附图说明
[0015]图1为本专利技术一实施方式中GelMA 水凝胶的聚合性、稳定性和粘附性等物理性质的示意图；图2为本专利技术一实施方式中脱细胞脊髓与GelMA混合支架的制备过程中的样品及分析图；
图3为神经干细胞的鉴定和通过活死细胞染色试验评估样品的生物相容性；图4为鬼笔环肽染色后的样品示意图；图5为EdU增殖实验过程中样品及分析图；图6为神经干细胞分化实验过程中样品及分析图。
具体实施方式
[0016]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步地详细说明。
[0017]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0018]本申请提供了一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架，由成年猪脱细胞脊髓制备而成的脱细胞基质液和GelMA水凝胶组成。
[0019]在一实施方式中，所述脱细胞基质液与所述GelMA水凝胶的混合比例为1:9或3:7。所述GelMA的浓度为5%。
[0020]请参阅图1，本申请还提供了一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架，其特征在于：由成年猪脱细胞脊髓制备而成的脱细胞基质液和GelMA水凝胶组成。2.根据权利要求1所述的促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架，其特征在于：所述脱细胞基质液与所述GelMA水凝胶的混合比例为1:9或3:7。3.根据权利要求1所述的促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架，其特征在于：所述GelMA的浓度为5%。4.一种促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：S1：成年猪脱细胞脊髓制备；S2：GelMA水凝胶的制备；S3：脱细胞脊髓与GelMA混合支架的制备。5.根据权利要求4所述的促进神经干细胞增殖分化的脱细胞脊髓
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GelMA水凝胶复合材料支架的...

【专利技术属性】
技术研发人员：居丁玥，董传明，王庆华，杨丹，陈世园，何文华，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：