多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及其培养基和应用技术

本发明专利技术公开了一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其包括：完全在3D悬浮条件下，利用BMP4和A8301将多能干细胞分化成为类滋养层细胞，再将类滋养层细胞分化成为间充质干细胞。还涉及用于上述多能干细胞分化为间充质干细胞的方法的含有BMP4、A8301的第一细胞分化培养基和第二细胞分化培养基以及上述间充质干细胞在组织器官再生上的应用。利用多能干细胞可以在3D悬浮条件下成球并扩增的能力，直接将其分化成为间充质干细胞，且分化效率高，产量大，纯度高，性能好，并且得到的间充质干细胞具有更优异的体外增殖能力，不易老化，具有更强的抗凋亡能力。可以满足临床对于间充质干细胞的大量需要，具有显著的应用价值。

Differentiation of pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells: methods, media and Applications

The invention discloses a method for differentiating pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells, which comprises: fully suspended in 3D, pluripotent stem cells are differentiated into trophoblast-like cells by BMP4 and A8301, and then trophoblast-like cells are differentiated into mesenchymal stem cells. The first cell differentiation medium and second cell differentiation medium containing BMP4, A8301 and the application of the mesenchymal stem cells in tissue and organ regeneration are also involved in the method for differentiation of the pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells mentioned above. Using the ability of pluripotent stem cells to globulate and expand in 3-D suspension, they can be directly differentiated into mesenchymal stem cells with high differentiation efficiency, high yield, high purity and good performance. Moreover, the obtained mesenchymal stem cells have better proliferation ability in vitro, less aging and stronger anti-apoptotic ability. It can meet a large number of clinical needs for mesenchymal stem cells and has significant application value.

【技术实现步骤摘要】
多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及其培养基和应用
本专利技术涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及其培养基和应用。
技术介绍
间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，存在于脐带血，胎盘，脂肪，骨髓血和结缔组织中，平时处于静息状态，当人体有创伤需要修复时，会被免疫系统激活，迁移到受损部位，进行增殖分化成相应的细胞，抑制炎性反应，促进血管再生并直接参与修复过程。间充质干细胞是出生后人体组织器官再生的重要成分。间充质干细胞可以从成体组织中分离出来，研究证明，其在体外特定环境可分化成为脂肪，骨，软骨甚至神经前体细胞，而且它还具有广泛的免疫调节功能，可以激活Treg细胞的增殖，抑制T，B淋巴细胞的活性，不仅促进组织再生，而且可用于自体免疫性疾病和器官移植后的抗宿主病和免疫排斥，并取得了显著的治疗效果。从成体组织分离的间充质干细胞效果虽好，但是具有一些难以克服的缺点。首先它们依赖志愿者供体，被采集组织对于供体来说不是一种愉悦的体验。而且，间充质干细胞的分离过程存在数目少，耗时长，成本高，质量难以控制等不利因素，难以克服。分离出的间充质干细胞在体外难以大量扩增，且成本高，易于衰老，细胞退化很快，无法充分满足临床需要，制约了其应用的范围和效果。多能干细胞如胚胎干细胞是一种可以永远自我更新、同时保持分化成为各种体细胞潜能的细胞。多能干细胞具有比间充质干细胞更强的增殖能力和更广泛的分化潜能，也可以在特定条件下定向分化成为间充质干细胞。胚胎干细胞比间充质干细胞具有更强的分化能力，更长的端粒和更活跃的端粒转移酶，故此更容易在体外增殖扩增，源源不断地产生间充质干细胞，满足用于组织再生和免疫调节的需要。而且，胚胎干细胞来源的间充质干细胞(EMSC)比成体组织来源的间充质干细胞表达更低的IL-6、更高的IL-8和更低的HLA，所以拥有更低的免疫原性，更加利于同种异体的治疗。目前多能干细胞在体外分化成为间充质干细胞是通过2D状态的贴壁培养进行，其效率较低，需要经过3-5个程序和多次传代，此间需要换瓶培养，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种完全在3D悬浮条件下将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，以达到相对于贴壁培养具有耗时短，效率高，并且分化产生的间充质干细胞具有更优异的体外增殖能力，不易老化，具有更强的抗凋亡能力。本专利技术的第二个目的在于提供一种培养基，以实现多能干细胞分化为间充质干细胞的培养，该过程具有耗时短，效率高，并且分化产生的间充质干细胞具有更优异的体外增殖能力，不易老化，具有更强的抗凋亡能力。本专利技术的第三个目的在于提供上述多能干细胞分化为间充质干细胞的方法分化得到的间充质干细胞在组织器官再生上的应用，使其能够快速促进组织器官的再生。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本专利技术提供的一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其包括：利用3D悬浮培养系统大量扩增多能干细胞，然后利用BMP4和A8301将多能干细胞分化成为类滋养层细胞，再将类滋养层细胞分化成为间充质干细胞，且两次分化过程均以细胞球形式的悬浮培养进行，整个过程无需传代或更换培养容器。本专利技术还涉及一种用于上述多能干细胞分化为间充质干细胞的方法的培养基，其包括第一细胞分化培养基和第二细胞分化培养基，第一细胞分化培养基包括BMP4、A8301以及基础培养基，基础培养基按重量份数计包括DMEM低糖培养基72-76份、血清替代物18-22份、非必须氨基酸0.5-1.5份以及3-7份L-谷氨酰胺；第二细胞分化培养基为基础培养基。本专利技术还涉及利用上述多能干细胞分化为间充质干细胞的方法分化得到的间充质干细胞在组织器官再生上的应用。相对于2D分化方式得到间充质干细胞的方法而言，本专利技术的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法方法耗时短，效率高，分化纯度高，并且得到的间充质干细胞具有更优异的体外增殖能力，不易老化，具有更强的抗凋亡能力。此外，利用其球状特性可以保证间充质干细胞于室温条件下存活一周之久，并不会影响其生物活性。常温条件下7-10天后的存活率高达90％，在恢复常规培养条件后，仍具有和正常对照细胞相似的生长速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化为骨，软骨和脂肪等各种组织的能力和免疫调节功能。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1的多能干细胞系Envy在3D球状悬浮条件下分化成为间充质干细胞的示意图。图1A所示为单层培养的人多能干细胞；图1B，C和D依次为细胞筛切割法制备干细胞球示意图、显微镜下干细胞3D生长状态图以及细胞球直径分布图；图2为将间充质干细胞球灌注到骨纤维支架上进行骨再生实验的过程图；图2A所示为两块人骨纤维支架；图2B所示为间充质干细胞充分浸润到图2A的两块纤维支架内部及连接处；图2C显示经过20天的成骨分化，间充质干细胞将图2A的两块纤维支架充分融合图片；图3为3D悬浮培养和2D贴壁培养的对比图；图4为实施例1得到的间充质干细胞球可以在体外直接分化成为软骨球和脂肪球，并被软骨特异性染料阿什利蓝染色和脂肪油滴特异性染料油红O染色。具体实施方式为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式或实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施方式的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及其培养基和应用进行具体说明。本专利技术的一些实施方式提供了一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其包括：利用BMP4和A8301将多能干细胞分化成为类滋养层细胞，再将类滋养层细胞分化成为间充质干细胞，且两次分化过程均以细胞球形式的悬浮培养进行。其中，骨形态发生蛋白-4(BMP4)又名BMP-2b，属于TGF-β超家族成员。与BMP-2同源，具有结构、功能的相似性。其不仅是一种具有超强能力骨诱导活性因子，对神经系统的胚胎发育、生长分化、肺的发育来说也是重要的调节因子。A8301是一种信号通路抑制剂，其可以显著促进重编程早期的MET过程，进而促进体细胞重编程效率。本专利技术的一些实施方式提供了一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其包括：将多能干细胞放置于含有BMP4和A8301的第一细胞分化培养基中进行第一次分化培养，再将第一次分化培养得到的类滋养层细胞在第二细胞分化培养基中进行第二次分化培养，得到间充质干细胞。根据一些实施方式，第一次分化培养的时间为2-5天，在该时间内可以将多能干细胞很好地分化为类滋养层细胞，第二次分化培养的时间为18-22天。根据一些实施方式，两次分化的培养条件为36-39℃，4-7％二氧化碳和85-92％湿度。BMP4和A8301是多能干细胞进行稳定分化的关键性成分，因此，其浓度也对多能干细胞的分化效果起到比较大的影响，根据一些实施方式，BMP4在第一细胞分化培养基中的浓度为5-15ng/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括：完全在3D悬浮条件下，利用BMP4和A8301将多能干细胞分化成为类滋养层细胞，再将所述类滋养层细胞分化成为间充质干细胞，且两次分化过程中无需传代或更换培养容器。

【技术特征摘要】
1.一种多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括：完全在3D悬浮条件下，利用BMP4和A8301将多能干细胞分化成为类滋养层细胞，再将所述类滋养层细胞分化成为间充质干细胞，且两次分化过程中无需传代或更换培养容器。2.根据权利要求1所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，将所述多能干细胞放置于含有所述BMP4和所述A8301的第一细胞分化培养基中进行第一次分化培养，再将所述第一次分化培养得到的所述类滋养层细胞在第二细胞分化培养基中进行第二次分化培养，得到间充质干细胞；优选地，所述第一次分化培养的时间为2-5天，所述第二次分化培养的时间为18-22天；优选地，所述BMP4在所述第一细胞分化培养基中的浓度为5-15ng/mL，优选6-13ng/mL，更优选8-12ng/mL，所述A8301在所述第一细胞分化培养基中的浓度为0.5-1.5μM，优选0.6-1.3μM，更优选0.8-1.2μM。3.根据权利要求2所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，所述第一细胞分化培养基包括所述BMP4、所述A8301以及基础培养基，所述基础培养基按重量份数计包括DMEM低糖培养基72-76份、血清替代物18-22份、非必须氨基酸0.5-1.5份以及3-7份L-谷氨酰胺；所述第二细胞分化培养基为所述基础培养基。4.根据权利要求1所述的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，其特征在于，所述多能干细胞是通过初始多能干细胞经过扩增培养得到的，将所述初始多能干细胞扩增培养是将所述初始多能干细胞的细胞集落通过细胞筛切割成细胞团，再将所述细胞团在扩增培养基中进行悬浮培养；优选地，所述细胞团进行悬浮培养的过程中添加增粘剂、基质胶、水凝胶或增稠剂，进一步优选地，所述增粘剂为食用级添加剂，更优选地，所述增粘剂为甲基纤维素，优选所述甲基纤维素的添加浓度为所述扩增培养基的质量的0.2％-0.5％；优选地，所述扩增培养基为mTeSR1细胞培养基，且所述mTeSR1细胞培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋斌，燕丽，徐仁和，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：中国澳门,82