人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途制造技术

本发明专利技术涉及人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途，属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域。人多能干细胞外泌体或基于人多能干细胞外泌体的制剂的用途包括：A、作为体外培养的维持成体干细胞的干性而抑制其衰老的添加剂应用，B、作为体外培养的维持各种组织原代培养细胞的增殖活性的添加剂应用，C、在制备治疗骨与软骨退行性病变的药物中的应用，D、在制备预防骨与软骨退行性病变的药物中的应用，E、在制备治疗骨坏死、骨不连、骨折、软骨损伤、肌腱损伤、冰冻肩或肌腱粘连等骨科疾病的药物中的应用。与现有技术相比，本发明专利技术多能干细胞分泌的外泌体亦具有强大的促进组织细胞再生，防治衰老，治疗骨类疾病的功能。

Exosomes derived from human pluripotent stem cells, preparations based on the exosomes and their applications

The invention relates to an exosome derived from human pluripotent stem cells, a preparation based on the exosome and its use, and belongs to the technical field of cell biology, molecular biology and drug research and development. The uses of human pluripotent stem cell exosomes or preparations based on human pluripotent stem cell exosomes include: A, the application of additives to maintain the stem of adult stem cells in vitro and to inhibit their aging, B, the application of additives to maintain the proliferation activity of primary cultured cells in various tissues in vitro, C, the application of drugs to treat bone and cartilage degenerative diseases. D. In the preparation of drugs to prevent bone and cartilage degenerative diseases, E. in the preparation of drugs to treat bone necrosis, nonunion, fracture, cartilage injury, tendon injury, frozen shoulder or tendon adhesion and other orthopaedic diseases. Compared with the prior art, the exosome secreted by the pluripotent stem cells of the invention also has powerful functions of promoting tissue cell regeneration, preventing and curing aging and treating bone diseases.

【技术实现步骤摘要】
人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途
本专利技术属于细胞生物学、分子生物学及药物研发
，尤其是涉及人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及其用途。
技术介绍
随着年龄的增长，人体各器官机能均会出现逐渐衰老，并引发相关疾病的发生。随着我国社会老龄化加剧，心脑血管疾病、骨与关节疾病、神经系统疾病以及代谢性疾病等的发病率显著上升，老年性疾病的危害日益突出。目前全世界有超过2亿的骨质疏松患者，而年龄超过50岁的女性中有1/3发生骨质疏松骨折，有很高的致残、致死率，严重威胁大众健康，带来极大的社会经济负担。此外，骨关节炎是一种在临床上非常常见的慢性退行性疾病，被列为老年人行动能力下降的首要病因，严重影响人们的生活质量。研发能有效防治骨退行性疾病发生与发展的技术显得尤为重要。干细胞再生医学技术是当前最有可能防治这些退行性疾病的技术，研究表明，移植成体干细胞或诱导人多能干细胞分化来的组织前体细胞治疗相关疾病具有明显疗效。但是，直接移植干细胞始终面临着细胞变异、致瘤风险、运输保存困难、难以产业化等问题。近年人们发现，干细胞产生的外泌体，具有与干细胞高度类似的功能，也可以促进组织再生，因此引起了广大学者的极大关注，为干细胞再生医学技术的转化应用带来了新的希望。外泌体是一类由细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，其携带供体细胞来源的多种生物活性物质包括DNA、RNA、蛋白等进入效应细胞，有效调控机体细胞信号转导。研究表明，干细胞分泌的外泌体通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，生理性修复或者清除机体损伤、病变和衰老的细胞，发挥抗炎、调节免疫、促进效应细胞增殖、迁移和分化、促进血管新生等功能。由于诱导人多能干细胞具有与胚胎干细胞相似的全能性，其分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。人多能干细胞产生的外泌体，可以抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，使效应细胞逆转至低分化状态，从而促进修复组织损伤。同时人多能干细胞来源的外泌体，也可以起到与组织干细胞类似的作用，如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能。胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESCs)与诱导人多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESCs和iPSCs具有多能性(Pluripotency)，即ESCs和iPSCs可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency)，即只能分化成为有限的几种细胞。因而ESCs和iPSCs与组织成体干细胞相比在促进组织器官再生更新方面功能更强大。但由于ESCs或iPSCs存在致瘤性，所以不能直接移植用于疾病的防治。而ESCs或iPSCs分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等，可能表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。虽然已有不少文献及专利报道了干细胞来源的外泌体在修复组织损伤中的应用，如已有报道骨髓间充质干细胞分泌的外泌体具有促进骨再生修复骨缺损的功能，由iPSCs定向诱导得到的间充质干细胞(iPSCs-MSCs)所分泌的外泌体也具有促进骨再生、血管新生、软骨再生，用于修复下肢缺血、皮肤创面、骨折、颅骨缺损、骨性关节炎、骨坏死等的修复治疗。中国授权专利CN101890050A公开了脐带间质干细胞来源膜性囊泡(外泌体)在治疗肝、肾或皮肤损伤疾病方面的功能。以上报道的均属于成体干细胞，由于ESCs或iPSCs属人多能干细胞，具有比成体干细胞更强的促进组织再生和抗衰老功能，其分泌的外泌体也应具有类似的强大功能。但目前尚未见直接应用ESCs或iPSCs分泌的外泌体防治骨退行性疾病的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种功能更强大的人多能干细胞(即ESCs或iPSCs)来源的外泌体、其制备方法、基于该外泌体的制剂及其制剂在防治骨科疾病方面的用途。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术第一方面：提供一种人多能干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体。在一种实施方式中，无血清培养体系选择市售的型号为TeSRTM-E8TM或mTeSR1的培养基。在一种实施方式中，收集纯化培养基中的外泌体的方法为：通过旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。在一种实施方式中，收集外泌体后，通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定，结果符合外泌体特征：直径范围50-150nm，透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构，其膜结构表面含有CD9，CD63等标志物。本专利技术第二方面：提供一种人多能干细胞外泌体，其采用本专利技术第一方面的制备方法获得。所述人多能干细胞外泌体包括人ESCs外泌体与人iPSCs外泌体。在一种实施方式中，所述人多能干细胞外泌体采用深低温保存，所述深低温保存指-80℃以下保存。本专利技术第三方面：提供基于所述人多能干细胞外泌体的制剂。A、悬浮剂：所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在，其溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。基于所述人多能干细胞外泌体的悬浮剂以人多能干细胞外泌体为功效成分。基于所述人多能干细胞外泌体的悬浮剂可通过口服、静脉注射，或直接在组织损伤部位注射(如关节腔内注射、骨折处注射等)或喷雾等形式进行使用。B、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体与载体结合形成缓释外泌体的复合物。所述载体包括各种水凝胶、生物膜、生物陶瓷材料、纳米结构的生物材料等。所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。C、含有人多能干细胞外泌体的添加剂：以人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。含有人多能干细胞外泌体的添加剂可以加入到各种药物中用于疾病的治疗，或加入到各种培养体系用于各种细胞培养。本专利技术第四方面：提供人多能干细胞外泌体的用途。A、作为体外培养的维持成体干细胞的干性而抑制其衰老的添加剂应用：所述成体干细胞包括间充质干细胞与组织特异干细胞，所述的间充质干细胞包括各种组织来源的间充质干细胞，如脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、尿液来源的间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等；所述组织特异干细胞包括肝干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、胰岛干细胞、上皮干细胞、肾脏干细胞、肺上皮干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞、角膜缘干细胞、黑色素干细胞、汗腺干细胞、肌腱干细胞、软骨前体细胞等。在一种实施方式中，将人多能干细胞外泌体或基于人多能干细胞外泌体的制剂按比例加到体外培养的人成体干细胞的培养基中，观察其对所培养的人成体干细胞的干性维持及抑制老化的效果。B、作为体外培养的维持各种组织原代培养细胞的增殖活性的添加剂应用：所述组织原代培养细胞包括血管内皮细胞、皮肤黑色素细胞、表皮细胞、肝上皮细胞、神经细胞、角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、成纤维细胞、胰岛β细胞、成骨细胞、软骨细胞和破骨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人多能干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体。2.根据权利要求1所述的人多能干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，收集纯化培养基中的外泌体的方法为：通过旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。3.根据权利要求1所述的人多能干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，无血清培养体系选择市售的型号为TeSRTM-E8TM或mTeSR1的培养基。4.采用权利要求1所述制备方法制备的人多能干细胞外泌体。5.根据权利要求4所述的人多能干细胞外泌体，其特征在于，所述的人多能干细胞外泌体包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞来源的外泌体。6.基于人多能干细胞外泌体的制剂，其特征在于，所述制剂选择以下形式中的任一种：A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；B、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体与载体结合形成缓释外泌体的复合物；C、含有人多能干细胞外泌体的添加剂：以人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。7.根据权利要求6所述基于人多能干细胞外泌体的制剂，其特征在于，所述载体包括各种水凝胶、生物膜、生物陶瓷材料、纳米结构的生物材料。8.如权利要求5所述人多能干细胞外泌体的应用，其特征在于，包括以下用途：A、作为体外培养的维持成体干细胞的干性而抑制其衰老的添加剂应用；B、作为体外培养的维持各种组织原...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪泱，吴复跃，何振东，
申请(专利权)人：上海睿泰生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31