一种促进血管化的钙粘素融合蛋白功能化改性组织工程支架的制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及hVE‑cad‑Fc融合蛋白在改性基质促进细胞血管化中的应用，优选地，hVE‑cad‑Fc融合蛋白的序列为SEQ ID NO：1所示，其中SEQ ID NO：2的序列表示hVE‑cad的序列；SEQ ID NO：3的序列表示Fc的序列。

【技术实现步骤摘要】
一种促进血管化的钙粘素融合蛋白功能化改性组织工程支架的制备与应用
本专利技术涉及组织工程支架改性及其促进血管化的生物医学基础与应用开发领域，尤其是研制一种人血管内皮细胞钙粘素融合蛋白改性的支架材料及其在细胞培养和再生医学领域的应用。
技术介绍
在过去的几十年里，组织工程及再生医学取得了长足的进步与发展，已经有多种白体组织替代物如皮肤、骨、软骨等成功试用于临床研究。然而，研究发现，由于细胞通过弥散获取营养和氧气的距离范围在150-200um以内条件限制，一些体积大、功能复杂的工程化组织如心肌、骨骼肌、肝脏等，在体外培养时很难超过1mm3，即使到体内也会由于宿主血管不能及时长入而导致中心部位细胞坏死。所以支架材料的快速而又充分的血管化是组织工程发展和临床应用面临的主要挑战之一。生物材料支架作为承担细胞生长的一种空间载体，在组织工程血管化研究中扮演着十分重要的角色。一般用于组织工程的材料从其来源可以分为天然生物材料，如透明质酸、海藻酸、壳聚糖等，人工合成生物材料，如PEG、PLGA、PCL、苯乙烯(PS)等。可注射透明质酸水凝胶正在越来越成为一种理想的生物支架材料由于其良好的生物相容性、无毒性及其机械力学性质，正在越来越成为一种理想的生物支架材料。已有研究报道表明，烯醇官能化聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子原位与硫醇化透明质酸(SH-HA)交联形成不同凝胶时间及机械硬度的水凝胶，在细胞培养和生物医学等领域具有广泛的应用。此外，研究表明RGD多肽改性的PAMAM/HA水凝胶显著改善HUVEC或hUC-MSCs的活力，增殖和对水凝胶基质的粘附。
技术实现思路
本专利技术人发现利用生物材料支架(例如丙烯酰肼化透明质酸水凝胶、PAMAM/HA水凝胶体系或PLGA支架)，并且利用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰，将会有利于生物支架材料内的血管化进程。例如，利用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶，能够结合融合蛋白与水凝胶的双重优势，对水凝胶血管化起到联动协同的促进作用。因此，本专利技术的一方面涉及血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白用于培养细胞或促进细胞血管化的应用。优选地，所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白连接在基质上。另一方面，本专利技术涉及制备改性基质，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架。在本专利技术的又一方面，涉及制备改性基质的方法，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素由SEQIDNO：2的序列表示，Fc由SEQIDNO：3的序列表示，优选血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的序列由SEQIDNO：1表示。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，优选来源于哺乳动物，更优选来源于人，猪或鼠。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白促进所述细胞向血管内皮样细胞的分化及血管化进程。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，所述水凝胶是透明质酸水凝胶，优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，其中所述丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸通过迈克尔加成反应而制备。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头与丙烯酰肼化透明质酸或PAMAM树枝状大分子连接，优选地，所述接头选自Fc结合肽，所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQIDNO：6)，HYFKFD(SEQIDNO：17，参见参考资料3和4)，HFRRHL(SEQIDNO：18，参见参考资料3和4)，FYWHCLDE(SEQIDNO：19，参见参考资料1和2)，SpA(staphylococcal蛋白A，参见参考资料1和2)。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架，优选地，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。在上述本专利技术各个方面的具体实施方案中，优选地，所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，优选来源于哺乳动物，更优选来源于人，猪或鼠。在本专利技术的另一个方面，涉及所述的改性基质在促进细胞(优选干细胞，优选间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞)分化(优选向血管内皮样细胞分化)及血管化进程中的应用。参考资料1.BiomimeticdesignofaffinitypeptideligandsforhumanIgGbasedonproteinA-IgGcomplex，BiochemicalEngineeringJournal，88(2014(1-11)2.FYWHCLDE-basedaffinitychromatographyofIgG：EffectofliganddensityandpurificationsofhumanIgGandmonoclonalantibody，JournalofChromatographyA，1355(2014)107-114.3.PerformanceofhexamerpeptideligandsforaffinitypurificationofimmunoglobulinGfromcommercialcellculturemedia，JournalofChromatographyA，1218(2011)1691-17004.PurificationofhumanimmunoglobulinGviaFc-specificsmallpeptideligandaffinitychromatography，JournalofChromatographyA1216(2009)910-918附图说明图1：丙烯酰肼化透明质酸的核磁共振氢谱检测，其中图1a为HA的核磁共振氢谱；图1b为HA-ADH的核磁共振氢谱；图1c为HA-AC的核磁共振氢谱。图2：含有hVE-cad-Fc的pcDNA3.1表达载体的构建。图3：纯化hVE-cad-Fc的蛋白质印迹和SDS-PAGE，其中M代表marker；P代表人IgG；R代表还原条件下提纯的hVE-cad-Fc：N代表非还原条件下hVE-cad-Fc。图4：融合蛋白hVE-cad-Fc在水凝胶中固定的1周时间内的酶联免疫吸附测定实验。图5：水凝胶成胶性、稳定性及降解性理化性质表征，其中图5a是不同交联剂下的成胶图；图5b是不同交联密度水凝胶在PBS溶液中的稳定性分析(图左)及低交联度水凝胶流变性分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.血管内皮细胞钙粘素‑Fc融合蛋白用于培养细胞或促进细胞血管化的应用，优选地，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。

【技术特征摘要】
2018.06.20 CN 20181063997611.血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白用于培养细胞或促进细胞血管化的应用，优选地，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。2.权利要求1所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素由SEQIDNO：2的序列表示，Fc由SEQIDNO：3的序列表示，优选血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的序列由SEQIDNO：1表示。3.权利要求1-2任一项所述的应用，其中所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，优选来源于哺乳动物，更优选来源于人，猪或鼠。4.权利要求3所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白促进所述细胞向血管内皮样细胞的分化。5.权利要求1-2任一项所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白连接在基质上，优选所述基质为水凝胶或多孔支架，更优选地，所述多孔支架为PLGA支架或PCL支架。6.权利要求5所述的应用，其中所述水凝胶是透明质酸水凝胶，优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。7.权利要求6所述的应用，其中所述丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。8.权利要求6所述的应用，其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是通过PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸发生迈克尔加成反应而制备。9.权利要求7-8任一项所述的应用，其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头与丙烯酰肼化透明质酸或PAMAM树枝状大分子连接，优选地，所述接头选自Fc结合肽，所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQIDNO：6)，HYFKFD(SEQIDNO：17)，HFRRHL(SEQIDNO：18)，FYWHCLDE(SEQIDNO：19)，SpA(staphylococcal蛋白A)。10.制备改性基质的方法，包含用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白修饰所述基质，其中所述基质为水凝胶或多孔支架，优选地，所述多孔支架选自PLGA支架或PCL支架，其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素；Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc。11.权利要求10所述的方法，其中所述改性基质用于促进细胞血管化(例如，促进细胞向血管内皮样细胞的分化)，优选地，所述细胞是间充质干细胞，iPS细胞或胚胎干细胞，优选来源于哺乳动物，更优选来源于人，猪或鼠。12.权利要求10-11任一项的方法，其中所述血管内皮细胞钙粘素由SEQIDNO：2的序列表示，Fc由SEQIDNO：3的序列表示，优选血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的序列由SEQIDNO：1表示。13.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，高超，谢敬辉，李小宁，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12