包括与不同的患者群体相容的细胞或患者特异性细胞的免疫相容性多潜能干细胞(pSC)广泛应用于再生医学疗法。本文中描述了使用例如使细胞具有接合性减少，抗原性上与许多患者群体相容的所需单倍体的单性生殖或允许产生患者特异性细胞的核转移等技术产生的免疫相容性pSC。本文中描述的方法涉及单性生殖、核转移或pSC细胞系产生。本文中还描述了免疫相容性pSC和通过以上提及的技术产生的细胞系的组合物。
Generation of parthenogenetic germ stem cells and patient-specific human embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer
Immunocompatible pluripotent stem cells (pSC), including cells compatible with different patient populations or patient-specific cells, are widely used in regenerative medicine therapy. Immunocompatible pSC is described using techniques such as haploid reproduction, which reduces cell conjugation, is antigenically compatible with many patient populations, or allows the generation of patient-specific cell nuclear transfer. The methods described in this paper involve parthenogenesis, nuclear transfer or pSC cell line production. Immunocompatibility pSC and combinations of cell lines produced by the techniques mentioned above are also described.
【技术实现步骤摘要】
使用体细胞核转移产生单性生殖干细胞和患者特异性人胚胎干细胞本申请是中国专利技术专利申请号201480021070.3的分案申请。其它申请的交叉引用本申请依据35U.S.C.§119(e)包括美国临时专利申请No.61/765,548和61/765,563的优先权要求，每一专利申请在2013年2月15日提出。
本专利技术涉及免疫相容性多潜能干细胞(pSC)，包括患者特异性pSC。本文中描述的方法涉及单性生殖或核转移且通过这些技术产生的免疫相容性pSC的组合物广泛应用于再生医学疗法。专利技术背景人多潜能干细胞(hPSC)具有在体内分化成实际上所有体细胞类型的显著能力(多潜能性)，同时维持呈未分化状态的增殖能力(自我更新)。hPSC的这些独特特征提供了产生可移植的细胞和组织材料以用于治疗在尤其糖尿病、骨关节炎和帕金森氏病(Parkinson’sdisease)范围内的疾病和病状的机会。因为许多人损伤和疾病是由包括单一细胞类型的细胞缺陷在内的细胞缺陷引起，所以用适当干细胞、祖细胞或体外分化细胞替换可以在临床中产生新颖的治疗方法。此外，虽然活的供体、尸体或胎儿来源已经用作移植材料的来源，但多潜能干细胞的自我更新能力进一步提供了可移植材料的几乎无限的资源。另一个益处是hPSC可以用患者特异性的方式产生，由此产生了降低免疫排斥风险和耐受性的治疗方法。因此，对包括免疫相容性hPSCS和患者特异性hPSC在内的再生细胞移植相当的狂热。一种产生免疫相容性hPSC的策略是促进从卵母细胞的单性生殖(即无性生殖)以产生用于hPSC分离的胚泡。简单地说，此方法依赖于人工诱发卵母细胞以在缺乏精子受精的情况下进行减数分裂和有丝分裂过程，产生二倍体(2个母系基因组)单性生殖体，其可以进一步培养成胚泡，从胚泡可以分离出hPSC。使用该单性生殖方法，分离的hPSC被称为单性生殖体衍生的人多潜能干细胞(pn-hPSC)。一种替代的方法允许通过体细胞核转移(SCNT)产生患者特异性hPSC。体细胞核转移涉及供体患者的体细胞的核分离和插入到去核的接受者卵母细胞中。供体核转移到接受者卵母细胞的细胞质通过使体细胞基因沉默和活化胚胎基因，引起所转移的供体核进行程序重排。从重构的卵母细胞，可以建立培养的胚泡以从内细胞团(ICM)分离hPSC。作为核转移的结果，hPSC(NT-hPSC)携带着患者特异性的患者的核遗传物质。技术程序相关的两个技术存在显著的重叠。举例来说，早期尝试实现NT-hPSC细胞系产生了pn-hPSC细胞系产生的意外并首先知道的情况。尽管单性生殖和SCNT技术的发展有前景，但目前存在排除切实可行的临床应用的显著限制。举例来说，已存在的单性生殖研究已经报导了在大概50％的供体卵母细胞中的成功卵母细胞活化，但一个关键的限制似乎是诱发胚泡的形成，其可能下降至低到15％或更少的活化卵母细胞。因为与核转移相关，所以使用常规技术，仅仅至多低至2％的重构卵母细胞越过达至胚泡形成的8细胞临限。总之，这些限制可能意味着小于10％的供体卵母细胞被成功地培养成pn-hPSC。随后的pn-hPSC可能具有其它不希望有的属性，比如非整倍性或核型不稳定性。由于目前不清楚允许一致和可再生的卵母细胞活化和胚泡形成的确切机制，所以当然，对这些过程的更透彻了解将有助于目前限制pSC谱系产生的障碍。举例来说，在单性生殖中减数分裂期期间发生的重组事件可以产生可变量的接合性。因此，实时目测这些事件不仅仅提高了胚泡形成和pn-hPSC细胞系产生的成功率，而且还有助于旨在实现所得pn-hPSC细胞的特异性遗传和免疫特征的操纵策略。类似地，当前用于获得NT-hPSC的SCNT方法使用来自体外受精临床的卵母细胞。同样由非整倍性、核型不稳定性和/或低效率的核程序重排引起的高失败率需要更大量的卵母细胞用于衍生NT-hPSC，且仍然局限于产生非患者特异性的细胞。因此，本领域中非常需要允许使用SCNT和/或单性生殖技术，一致、有效地产生免疫相容性和患者特异性hPSC的技术。本文中描述了用于建立免疫相容性和/或患者特异性hPSC的技术。在一个方面，描述了使用改良的技术的有效SCNT和/或单性生殖。此包括改善显微操作以减少细胞破坏；在不使用苛刻着色剂和/或紫外线暴露下用于实时目测的偏光显微术。更重要地，已经通过应用甲基化改变剂消除了与有效胚泡产生有关的关键屏障，所述甲基化改变剂促进了重构的卵母细胞内基因组的活化，以及有丝分裂结构(例如中心粒)从精子衍生物添加以促进胚泡扩张。应用这些改良的技术允许实现表达共同人白细胞抗原(HLA)单倍体的pn-hPSC库，从而提供了免疫学上与宽群体部分相容的细胞。在所有方面，pn-hPSC和NT-hPSC可以在无动物蛋白的培养基上生长，对于最终涉及人患者的临床应用为重要的，并提供遗传学上和表观遗传学上稳定和多潜能的可移植细胞。专利技术概要本文中描述了一种产生单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hPSC)的方法，其包括通过在活化培养基中培育来活化卵母细胞，通过在后活化培养基中培育所述活化的卵母细胞产生单性生殖体，通过在培养基中培育所述单性生殖体形成胚泡，并从所述胚泡分离内细胞团(ICM)细胞，其中所述ICM细胞能够进一步培养为pn-hPSC细胞系。在其它实施方案中，所述活化培养基包括钙离子载体。在其它实施方案中，所述钙离子载体包括伊屋诺霉素(ionomycin)、A23187、白僵菌毒素(beauvericin)、X-537A和/或燕麦曲菌素(avenaciolide)。在其它实施方案中，所述后活化培养基包括6-DMAP、嘌呤霉素(puromycin)、乙醇、放线菌酮(cycloheximide，CHX)、曲古霉素A(trichostatinA，TSA)和/或细胞分裂抑素B(cytochalasinB，CB)。在其它实施方案中，所述后活化培养基包括不阻止第二极体排出的化合物。在其它实施方案中，卵母细胞包括中期II(MII)期卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞包括中期I(MI)期卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞包括单一原核卵母细胞。在其它实施方案中，pn-hPSC细胞系是杂合的。在其它实施方案中，pn-hPSC细胞系是纯合的。在其它实施方案中，pn-hPSC细胞系包括具有与至少1％的群体免疫相容的人白细胞抗原(HLA)单倍体。在其它实施方案中，HLA单倍体包括HLA-A、HLA-B和HLA-DR。在其它实施方案中，所述方法包括注射精子因子至卵母细胞。在其它实施方案中，卵母细胞是在CARM1和/或Esrrb存在下培育。本文中进一步描述了一种单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hPSC)，其包括从单性生殖体衍生的胚泡的内细胞团(ICM)细胞分离的多潜能细胞。在其它实施方案中，单性生殖体衍生的胚泡包括通过在活化培养基中培育卵母细胞所产生的单性生殖体。在其它实施方案中，所述活化培养基包括钙离子载体。在其它实施方案中，所述钙离子载体包括伊屋诺霉素、A23187、白僵菌毒素、X-537A和/或燕麦曲菌素。在其它实施方案中，单性生殖体衍生的胚泡包括通过在后活化培养基中培育活化的卵母细胞产生单性生殖体。在其它实施方案中，所述后活化培养基包括6-DMAP、嘌呤霉素、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn‑hPSC)的方法，其包括：通过在活化培养基中培育来活化卵母细胞；通过在后活化培养基中培育所述活化的卵母细胞产生单性生殖体；通过在培养基中培育所述单性生殖体形成胚泡；以及从所述胚泡分离内细胞团(ICM)细胞，其中所述ICM细胞能够进一步培养为pn‑hPSC细胞系。
【技术特征摘要】
2013.02.15 US 61/765,548;2013.02.15 US 61/765,5631.一种产生单性生殖体衍生的人多潜能干细胞系(pn-hPSC)的方法，其包括：通过在活化培养基中培育来活化卵母细胞；通过在后活化培养基中培育所述活化的卵母细胞产生单性生殖体；通过在培养基中培育所述单性生殖体形成胚泡；以及从所述胚泡分离内细胞团(ICM)细胞，其中所述ICM细胞能够进一步培养为pn-hPSC细胞系。2.如权利要求1所述的方法，其中所述活化培养基包含钙离子载体。3.如权利要求2所述的方法，其中所述钙离子载体包括伊屋诺霉素、A...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑永基，李东律，
申请(专利权)人：圣光医疗财团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR
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