一种小分子胶原蛋白的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将未经色谱纯化过的胶原蛋白于25～37℃下放置3～14天。本发明专利技术能够有效制备分子量在10～50KD大小的胶原蛋白，无需借助γ射线发生装置、蛋白酶等装置或试剂，成本低廉。本发明专利技术还能通过调节制备时间来得到特定主蛋白分子量的胶原蛋白，操作易行。本发明专利技术得到的胶原蛋白可有效促进细胞增殖，发明专利技术人经实验证明，本发明专利技术的小分子胶原蛋白相比大分子胶原蛋白对IEC‑6细胞的促增殖生物活性显著更高。根据常识，组织修复与细胞增殖息息相关，因此，将本发明专利技术应用于组织修复相关的产品(例如药物、保健品等)的生产上，具有十分良好的前景。

Preparation of small molecule collagen

【技术实现步骤摘要】
一种小分子胶原蛋白的制备方法
本专利技术涉及胶原蛋白制备领域，尤其涉及一种小分子胶原蛋白的制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是一种广泛存在于有机体中的结构蛋白，是皮肤、软骨、动脉血管壁及结缔组织的主要成分。胶原蛋白适度降解后分子量降低，成为小分子胶原蛋白。后者除了具备易吸收(吸收率可达95-100％)、低抗原性、低过敏性、载体运输能力强等肽的典型特征外，还具有抗氧化、免疫调节、增强骨强度和促进软骨再生等多种生理活性，在医药、食品、化妆品领域有着广阔的应用前景。目前，小分子胶原蛋白的制备主要通过蛋白酶降解、色谱分离或γ射线照射等方法处理胶原蛋白，其成本较高。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种小分子胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：将未经色谱纯化过的胶原蛋白于一定温度下放置一定时间；所述小分子胶原蛋白的分子量为10～50KD；所述一定温度为25～37℃；所述一定时间为3～14天。如前述的制备方法，所述胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述胶原蛋白由特定DNA表达而来，所述特定DNA含有如SEQIDNO.2所示的序列。如前述的制备方法，所述一定温度为25℃。进一步地，所述一定时间为4天。如前述的制备方法，所述一定温度为37℃。进一步地，所述一定时间为3天。本专利技术还提供了前述方法制备得到的小分子胶原蛋白产品。本专利技术还提供了前述小分子胶原蛋白产品在药物或保健品制备中的用途。如前述的用途，所述药物或保健品是促进细胞增殖或组织修复的药物或保健品。本专利技术能够有效制备分子量在10～50KD大小的胶原蛋白，无需借助γ射线发生装置、蛋白酶等装置或试剂，成本低廉。本专利技术还能通过调节制备时间来得到特定主蛋白分子量的胶原蛋白，操作易行。本专利技术得到的胶原蛋白可有效促进细胞增殖，专利技术人经实验证明，本专利技术的小分子胶原蛋白相比大分子胶原蛋白对IEC-6细胞的促增殖生物活性显著更高。根据常识，组织修复与细胞增殖息息相关，因此，将本专利技术应用于组织修复相关的产品(例如药物、保健品等)的生产上，具有十分良好的前景。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：实施例中胶原蛋白4℃放置的蛋白电泳图。图2：实施例中胶原蛋白25℃放置的蛋白电泳图。图3：实施例中胶原蛋白37℃放置的蛋白电泳图。图4：胶原蛋白20170504流穿样品4℃放置的蛋白电泳图。图5：胶原蛋白20170509流穿样品4℃放置的蛋白电泳图。图6：胶原蛋白20170510流穿样品4℃放置的蛋白电泳图。图7：胶原蛋白20170504高盐洗脱样品4℃放置的蛋白电泳图。图8：胶原蛋白20170509高盐洗脱样品4℃放置的蛋白电泳图。图9：胶原蛋白20170510高盐洗脱样品4℃放置的蛋白电泳图。图10：胶原蛋白20170504流穿样品25℃放置的蛋白电泳图。图11：胶原蛋白20170509流穿样品25℃放置的蛋白电泳图。图12：胶原蛋白20170510流穿样品25℃放置的蛋白电泳图。图13：胶原蛋白20170504高盐洗脱样品25℃放置的蛋白电泳图。图14：胶原蛋白20170509高盐洗脱样品25℃放置的蛋白电泳图。图15：胶原蛋白20170510高盐洗脱样品25℃放置的蛋白电泳图。图16：胶原蛋白20170504流穿样品37℃放置的蛋白电泳图。图17：胶原蛋白20170509流穿样品37℃放置的蛋白电泳图。图18：胶原蛋白20170510流穿样品37℃放置的蛋白电泳图。图19：胶原蛋白20170504高盐洗脱样品37℃放置的蛋白电泳图。图20：胶原蛋白20170509高盐洗脱样品37℃放置的蛋白电泳图。图21：胶原蛋白20170510高盐洗脱样品37℃放置的蛋白电泳图。图22：小分子胶原蛋白样品与大分子胶原蛋白样品在不同浓度条件下对IEC-6细胞增殖数量的比较。具体实施方式实施例小分子胶原蛋白的制备1.胶原蛋白材料重组胶原蛋白发酵上清，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，表达该蛋白的基因具有SEQIDNO.2所示序列；该蛋白的理论氨基酸数目是1067，理论分子量是95549。SEQIDNO.1：SEQIDNO.2：2.方法蛋白样品经无菌过滤后，分装到EP管中，0.5-1ml/支，分别于4℃、25℃及37℃放置，为期14天，每天取样并电泳观察降解情况。每次电泳上样量为10μg蛋白。3.结果(1)如图1所示，于4℃放置的胶原蛋白，降解缓慢，在第14天仍可观察到100KD～150KD处的蛋白条带，主带降解至50KD附近(37～50KD)。(2)如图2所示，于25℃放置的胶原蛋白发酵液上清，降解迅速，在第3天100KD～150KD处蛋白基本降解完毕，在第4天，观察到50KD处附近蛋白明显增加，主带降至50KD附近(37～50KD)，且25KD以下蛋白较少。于15KD处蛋白呈现递增趋势，在第14天，主带降至15KD处附近(10～20KD)。(3)如图3所示，于37℃放置，发酵液上清降解迅速且趋势明显，第2天100KD～150KD处的蛋白带基本降解完全，在第3天50KD附近(37～50KD)蛋白明显增加，且25KD以下分子量蛋白较少。随实验进行，主蛋白带逐渐降至15KD附近(10～20KD)。4.结论制备小分子胶原蛋白(10～50KD的胶原蛋白)可在25℃条件下放置4天，或是于37℃放置3天，皆可使主蛋白带降至50KD附近(37～50KD)，且此条件下，高分子量(75KD及以上)蛋白基本降解完全，低分子量(25KD及以下)蛋白只部分降解。对比例色谱纯化后的胶原蛋白自然降解实验1.胶原蛋白材料经过色谱纯化后的胶原蛋白色谱纯化的大致步骤为：平衡、上样、再平衡、洗脱、再生、CIP(在位清洗)。色谱参数如下：层析柱：50mm×200mm，层析填料：GESephroseSPHP，柱体积：400ml平衡液：20mMPB+130mMNaCl，pH6.2洗脱液：20mMPB+280mMNaCl，pH6.2再生液：2MNaClCIP液：0.5MNaOH上样流速：10mL/min，平衡及洗脱流速：20mL/min其样品信息如表1所示。表1流穿及高盐洗脱样品信息2.方法同实施例。3.结果3.1于4℃放置结果(1)流穿样品电泳由图4(纯化日期/批号20170504)、5(纯化日期/批号20170509)和6(纯化日期/批号20170510)可知，于4℃放置的样品在14天的实验中无明显的降解趋势，较为稳定。虽然20170510样品在第13天的电泳结果呈现蛋白降解，条带变浅的现象，但由于其第14天的结果与前12天保持一致，无明显降解，故考虑第13天取样的样品可能染菌，则第13天的电泳结果不作为评判的依据。(2)洗脱样品电泳图7～9依次为20170504、20170509及20170510的高盐洗脱样品的电泳。由图可知，在4℃条件下放置14天，同流穿相同，皆无明显降解趋势。20170510样品在第14天的电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将未经色谱纯化过的胶原蛋白于一定温度下放置一定时间；所述小分子胶原蛋白的分子量为10～50KD；所述一定温度为25～37℃；所述一定时间为3～14天。

【技术特征摘要】
1.一种小分子胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将未经色谱纯化过的胶原蛋白于一定温度下放置一定时间；所述小分子胶原蛋白的分子量为10～50KD；所述一定温度为25～37℃；所述一定时间为3～14天。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白由特定DNA表达而来，所述特定DNA含有如SEQIDNO.2所示的序列。4.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫，吕自力，单旭东，杜娟，罗斌，
申请(专利权)人：成都中医药大学，
类型：发明
国别省市：四川,51