重组人源胶原蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种重组人源胶原蛋白及其应用，编码该所述重组人源胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组人源胶原蛋白从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。根据本发明专利技术实施例的所述重组人源胶原蛋白，通过在人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链的两端都设计有特异性亲和纯化标签，该重组人源胶原蛋白易于分离纯化和检测，且该重组人源胶原蛋白具有更高的分子量和特殊的理化性质，易于发酵和表达，产量高，用途广。

Recombinant human collagen and its application

【技术实现步骤摘要】
重组人源胶原蛋白及其应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体地，本专利技术涉及一种重组人源胶原蛋白及其应用。
技术介绍
人体的衰老在表观上表现为皮肤状况的改变，如松弛、起皱等。皮肤的状况直接影响外表的美观和精神状态。皮肤中胶原蛋白的含量高达75％，它维持着皮肤的弹性和水润。胶原蛋白的流失是皮肤衰老的主要原因。提高皮肤中胶原蛋白的含量，有助于皮肤对抗衰老，恢复皮肤弹性。I型胶原蛋白是目前已发现的29中胶原蛋白中组织分布最为广泛和含量最高的胶原蛋白，约占90％，约占动物机体总蛋白的27％左右。其在新组织的形态发生和细胞代谢中，赋予新组织机械强度和生化特性，对维护细胞、组织等的正常生理功能和损伤修复起着重要作用。I型胶原蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、无细胞毒性、抗氧化性等功能，并能促进细胞粘附和细胞增殖等功效，可广泛应用在医学、美容、化妆品、保健品等领域中。其在皮肤损伤修复、整形美容、增强机体免疫力等方面的作用也已获得共识。目前国内重组胶原蛋白的相关研究已经很多，如西北大学和华南理工大学等均有相关的研究报道，但其主要研究的是胶原蛋白短肽片段，尚无有关重组人源I型胶原α2链全长肽的报道。目前市场上已流通的重组I型胶原蛋白肽段，虽已表现出较优的功效，但因其片段较小，分子量低，也限制了其功能的发挥。I型胶原蛋白全长肽拥有更多的纤连蛋白FN结合位点，更容易发挥其胶原功能活性；其具有更高的分子量，拥有独特的生理生化特性，如其易形成一层透气的薄膜、抗降解时间长、交联后交联度更高，性能更优异；且其随时间推移发生的缓慢降解，可以更持久的补充胶原蛋白短肽，甚至与某些药物结合可以起到缓释作用。因此，为了充分开发其潜在价值，亟需解决其全长肽的生产与检测问题。目前胶原蛋白的分理纯化，多采用分子筛和离子交换树脂进行分离，而胶原蛋白因其独特的G-X-Y结构使其很难分离开，尤其与同种胶原的降解片段，且该提纯工艺操作复杂及不同批次间提纯工艺难以稳定，导致市场上胶原蛋白短肽产品多为短肽及其降解物的混合物，很难获得具有单一肽链的胶原产品，限制了其广泛应用。目前产品中胶原检测，主要是利用生物质谱技术研究胶原蛋白的类型和含量，该方法只能检测其是胶原，但不能确认其是否为全长片段，因此不适宜长片段肽链的全长性检测。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述技术问题之一。为此，本专利技术提出一种重组人源胶原蛋白，该重组人源胶原蛋白纯化和鉴定方便，易于检测。本专利技术还提出一种重组人源胶原蛋白的应用。根据本专利技术第一方面实施例的重组人源胶原蛋白，编码该所述重组人源胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述重组人源胶原蛋白从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。根据本专利技术上述实施例的重组人源胶原蛋白，还可以具有如下的附加技术特征：根据本专利技术的一个实施例，所述氨基端亲和纯化标签为Flag标签，所述羧基端亲和纯化标签为6His标签。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白全长为1056个氨基酸。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白的基因序列如SEQIDNO：9所示。根据本专利技术的一个实施例，所述人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链的基因序列由天然胶原基因序列将其密码子按照宿主密码子的使用频率进行调整得到。根据本专利技术的一个实施例，所述宿主为毕赤酵母，所述调整为将所述天然胶原基因序列中的酵母不常用密码子替换为其惯用密码子。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白在进行引物扩增构建时，在密码子优化后的胶原基因序列的5′端引入编码Flag标记序列的基因序列，在3′端引入编码6His序列的基因序列后进行扩增。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白通过Ni-NTAHis·Bind树脂和Anti-Flag亲和纯化凝胶吸附的方法从所述毕赤酵母的发酵液中提取并纯化。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白应用于外用护肤品，所述外用护肤品各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源胶原蛋白0.01％～0.1％；保湿剂1％-3％；丁二醇1％-3％；透明质酸钠0.01％-0.1％；黄原胶0.01％-0.1％；尿囊素0.01％-0.2％；泛醇0.1％-1％；甘草酸二钾0.1％-0.5％；EDTA·Na20.01％-0.1％；β-葡聚糖0.1％-0.5％；芦芭油0.1％-0.5％；乳酸钠0.1％-0.3％；水溶性氮酮0.1％-1％；丝肽0.01％-0.1％；其余为纯化水。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白应用于导入性护肤品，所述导入性护肤品各组分的质量分数为：根据上述实施例所述的重组人源胶原蛋白0.1％-0.5％；保湿剂1％-10％；透明质酸钠0.1％-0.5％；小分子透明质酸钠0.01％-0.05％；氯化钠0.9％；其余为纯化水。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白应用于制备胶原蛋白凝胶敷料，所述胶原蛋白凝胶敷料各组分的质量分数分别为：根据上述实施例所述的重组人源胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％-10％；卡波姆0.1％-4％；三乙醇胺0.1％-10％；其余为纯化水。根据本专利技术的一个实施例，用于制备原蛋白贴敷料，所述原蛋白贴敷料各组分的质量分数分别为：根据上述实施例所述的重组人源胶原蛋白0.1％～0.5％；保湿剂1％-10％；黄原胶0.1％-2％；其余为纯化水。根据本专利技术的一个实施例，所述重组人源胶原蛋白应用于制备胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料，所述胶原蛋白基皮肤黏膜保护剂敷料各组分的质量分数分别为：根据上述实施例所述的重组人源胶原蛋白0.1％～1％；透明质酸钠0.1％～1％；保湿剂0～40％；其余为纯化水。根据本专利技术实施例的重组人源胶原蛋白至少具有以下技术效果：(1)本专利技术的重组人源胶原蛋白在其两端携带有双特异性标签，既可以通过亲和纯化获得全长胶原蛋白，亦可以通过夹心法ELISA检验鉴定其在产品中的状态和含量；(2)本专利技术的重组人源胶原蛋白的基因序列依据毕赤酵母惯用密码子对其基因序列进行了密码子优化，消除了不常用密码子及发夹结构，通过同义转换，优化mRNA的二级结构，避免了密码子利用效率限制导致的翻译效率低下，使其更适于在毕赤酵母中表达；(3)与常规的重组胶原片段和明胶相比，重组人源胶原蛋白为全长的胶原蛋白，因而具有很高的分子量，作为生物大分子，拥有更优的化学结构和性能，可作为生物医用材料；(4)与传统胶原蛋白生产方法相比，重组人源胶原蛋白为真核表达系统表达的人源化的重组胶原蛋白，且能被分泌到细胞外，其无病毒、内毒素隐患，并避免了免疫排斥反应，其生物相容性和生物安全性更高，工艺过程对环境更友好，产品更安全。(5)本专利技术的重组人源胶原蛋白的亲水性和稳定性好，其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100％相同，其结构和生物活性更接近于天然胶原蛋白。(6)本专利技术的重组人源胶原蛋白携带有N端的Flag标签和C端的6His标签，利用其双特异性亲和纯化标签，纯化步骤简单，产物纯度高，可满足微创、整形美容、生物医用材料等产品使用。附图说明图1为根据本专利技术实施例的构建的重组人源胶原蛋白的分泌表达重组质粒pPIC9k-colIα2图谱；图2为根据本专利技术实施例的重组人源胶原蛋白在制备过程中所采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，编码该所述重组人源胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组人源胶原蛋白从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。

【技术特征摘要】
2019.03.19 CN 20191020649941.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于，编码该所述重组人源胶原蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述重组人源胶原蛋白从氨基端依次包含：氨基端亲和纯化标签、人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链以及羧基端亲和纯化标签。2.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述氨基端亲和纯化标签为Flag标签，所述羧基端亲和纯化标签为6His标签。3.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白全长为1056个氨基酸。4.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白的基因序列如SEQIDNO：9所示。5.根据权利要求1所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述人源I型胶原蛋白α2链成熟肽链的基因序列参照天然胶原基因序列将其密码子按照宿主密码子的使用频率进行调整得到。6.根据权利要求5所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述宿主为毕赤酵母，所述调整为将所述天然胶原基因序列中的酵母不常用密码子替换为其惯用密码子。7.根据权利要求4所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白在进行引物扩增构建时，在权利要求5所得胶原基因序列的5′端引入编码Flag标记序列的基因序列，在3′端引入编码6His序列的基因序列后进行扩增。8.根据权利要求6所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白通过Ni-NTAHis·Bind树脂和Anti-Flag亲和纯化凝胶吸附的方法从所述毕赤酵母的发酵液中提取并纯化。9.一种重组人源胶原蛋白的应用，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白应用于外用护肤品，所述外用护肤品各组分的质量分数为：根据权利要求1-8中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亮，张永正，
申请(专利权)人：江苏悦智生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32