本发明专利技术涉及一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，该胶原肽的氨基酸序列为Gly‑Val‑Gla，UPLC‑MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。本发明专利技术还涉及一种上述胶原肽的制备方法，包括采用双酶混合水解、超滤、凝胶柱层析技术联用，整个制备过程简单易控，酶解效率高，且所得胶原肽安全无副作用、具有较高的ACE抑制活性，也具有较好的热稳定性，且该胶原肽经胃肠消化道消化后仍保持有较高的ACE抑制活性；另外，本发明专利技术制备胶原肽所采用的原料为加工废弃物鱼皮，有效避免了环境污染、提高了资源的利用率，本发明专利技术具有较高的实用价值以及商用价值。
A collagen peptide from horseface fish skin with ACE inhibitory activity and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽及其制备方法
本专利技术属于水产品加工综合利用领域，具体涉及一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，本专利技术还涉及该马面鱼皮胶原肽的制备方法。
技术介绍
目前高血压是一种常见的心血管疾病，严重影响着人类的健康。血压是在血管紧张素转化酶(ACE)作用下进行调节的，ACE催化不具活性的血管紧张素I转变为有收缩血管平滑肌活性、引起血压升高的血管紧张素II；另一方面，ACE可使具有血管舒张作用的舒缓激肽转化为没有活力的缓释肽。ACE抑制剂通过抑制ACE活性，阻断ACE引起的这两种生化反应过程，起到降压作用。ACE抑制剂是常用降压药物之一，如赖诺普利、卡托普利等，但是这些化学合成类的药物虽有缓解高血压症状的效果，却存在一定毒副作用，如咳嗽、皮疹、高血钾、头晕、血压过低等。源于天然蛋白质的具有ACE抑制活性的蛋白肽因其食用安全性高，无毒副作用，且对动物正常血压无降压作用等优点引起了人们广泛关注。制备具有ACE抑制活性的蛋白肽的方法主要有化学降解法、酶降解法、化学合成法、微生物发酵法等，其中酶降解法条件温和、过程易控，采用食源性蛋白质制备得到的蛋白肽天然安全，极具发展前景，也是目前研究的热门方向之一。水产加工过程中会产生大量鱼皮、鱼骨等副产物，直接丢弃不仅污染环境，也造成了资源的浪费。以马面鱼为例，鱼皮占8.5％～9.4％，皮厚且硬，不宜食用，但其含丰富的胶原蛋白，如能对其充分利用，通过酶法加工鱼皮胶原蛋白获得具有ACE抑制活性的胶原肽，将会取得显著的经济效益和社会效益，也为高值化开发水产加工副产物提供了新的途径。但是，现有技术中，以马面鱼皮为原料制备具有ACE抑制活性的胶原肽的工艺鲜见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种ACE抑制活性高、热稳定性好且经胃肠环境消化后仍能保持较高活性的马面鱼皮胶原肽。本专利技术所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种上述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，该方法将双酶混合水解技术与超滤、凝胶柱层析技术联合使用，科学合理、易于操作。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Gly-Val-Gla，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。一种上述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)马面鱼皮的前处理将马面鱼皮洗净、绞碎，然后进行脱脂及除杂蛋白处理，处理完毕后对碎鱼皮进行清洗；(2)马面鱼皮胶原蛋白的制备步骤(1)最后所得碎鱼皮采用酸溶液浸泡、离心后收集上清液，向该上清液中加入NaCl后离心处理，将所得沉淀用酸溶液复溶，然后进行透析处理，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白；(3)胶原蛋白的双酶混合水解将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用缓冲液配制为溶液，采用ProteaseNAmano和胰蛋白酶在一定温度下混合水解，水解完毕后收集上清液备用；(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的胶原肽组分，再用SephadexG-15凝胶柱进行柱层析分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，各组分进行ACE抑制活性检测，活性最高的组分经冷冻干燥后即得所述的具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽。作为优选，步骤(1)的具体过程为：将洗净、绞碎的马面鱼皮按固液重量比1:10～20加入体积浓度为5～15％的异丙醇中，浸泡脱脂10～20h后过滤除去异丙醇，用蒸馏水清洗滤渣后再将该滤渣按固液重量比1:5～10加入质量浓度为7～10％的NaCl溶液中，浸泡12～24h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用。上述反应中，脱脂剂可选用正己烷、正丁醇、石油醚、异丙醇中的一种或多种，在相同的实验条件下，异丙醇的脱脂率最高，为62.45％；正丁醇次之，为44.97％；石油醚和正己烷分别为26.67％和26.61％。由此可见，异丙醇对鱼皮脱脂的影响最大，可作为脱脂溶剂。最优脱脂条件为：异丙醇浓度10％，料液比1:15，脱脂时间20h。因此在上述步骤中，脱脂剂的选择为最优选为异丙醇。作为改进，步骤(2)的具体过程为：将步骤(1)最后所得滤渣按固液重量比1:10～30加入浓度为0.1～0.5mol/L的乙酸中浸泡12～36h，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理收集上清液；向所得上清液中加入NaCl至NaCl质量浓度为6～9％，然后在8000～10000r/min的条件下离心处理，所得沉淀用0.4～0.6mol/L的酸溶液复溶后，透析24～30h，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼胶原蛋白。本专利技术中所采用的的酸溶液可以为盐酸、乙酸、柠檬酸中的一种或多种，在相同的实验条件下，以胶原蛋白的提取量为指标，分别选用0.3M(mol/L)盐酸、乙酸、柠檬酸，料液比1:10，4℃下提取24h，以胶原蛋白得率为指标，从而确定最佳提取液。用盐酸、柠檬酸及乙酸提取时的得率分别为62.86、110.9和249.5mg/g，(提取条件：酸浓度0.38M，料液比1:30，时间33h，其得率为365.7mg/g)。因此在本专利技术中，酸溶液最优选为盐酸溶液。再改进，步骤(3)的具体过程为：用pH为6.5～8.5的磷酸缓冲液将上述马面鱼皮胶原蛋白配成质量浓度为2～6％的溶液，然后加入ProteaseNAmano和胰蛋白酶，20～50℃下酶解2～7h得到水解液，将水解液沸水浴8～15min，冷却后在8000～10000r/min的条件下离心处理并收集上清液备用。优选地，步骤(4)中收集220nm下有吸收峰的组分时，以pH为7.2的磷酸盐缓冲液为洗脱液，在0.2～0.3mL/min的流速下进行分离。在上述方案中，所述ProteaseNAmano和胰蛋白酶的酶用量均≥1200U/g。在上述方案中，所述的酶ProteaseNAmano生产厂家为日本Amano公司，胰蛋白酶生产厂家为北京Solarbio公司。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术的马面鱼皮胶原肽具有较高的ACE抑制活性，同时也具有较好的热稳定性，该胶原肽在20、40、60、80、100℃下分别保温2h后，对ACE的抑制活性均保持在91％以上；该胶原肽经胃消化道消化后其ACE抑制活性保持率为89.42％，经胃肠消化道消化后其ACE抑制活性保持率为79.76％，仍保持了较高的ACE抑制活性，因此，本专利技术中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽作为功能因子添加到健康食品、化妆品中具有较好应用前景；(2)本专利技术采用双酶混合水解与超滤、凝胶柱层析联用，整个制备过程简单易控、酶解效率高，且所得具有ACE抑制活性的胶原肽安全无副作用；(3)本专利技术所采用的原料为海洋低值鱼类马面鱼的加工废弃物，有效避免了环境污染、提高了资源利用率。附图说明图1为本专利技术中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的UPLC-MS图谱；图2为本专利技术中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽对ACE的抑制作用图；图3为温度对本专利技术中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的活性影响图；图4为胃肠消化酶对本专利技术中具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的活性影响图。:具体实施方案以下结合具本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，其特征在于，所述胶原肽的氨基酸序列为Gly‑Val‑Gla，UPLC‑MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。
【技术特征摘要】
1.一种具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽，其特征在于，所述胶原肽的氨基酸序列为Gly-Val-Gla，UPLC-MS检测给出分子离子峰为[M]+329m/z。2.一种制备权利要求1所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)马面鱼皮的前处理将马面鱼皮洗净、绞碎，然后进行脱脂及除杂蛋白处理，处理完毕后对碎鱼皮进行再次清洗；(2)马面鱼皮胶原蛋白的提取将步骤(1)最后所得碎鱼皮采用酸溶液浸泡，离心后收集上清液，向该上清液中加入NaCl后再次离心处理，将所得沉淀用酸溶液复溶，然后进行透析处理，所得溶液冷冻干燥后即为马面鱼皮胶原蛋白；(3)胶原蛋白的双酶混合水解将步骤(2)所得马面鱼胶原蛋白用缓冲液配制为溶液，加入ProteaseNAmano和胰蛋白酶进行混合水解，水解完毕后收集上清液备用；(4)具有ACE抑制活性的胶原肽的分离对步骤(3)所得上清液进行超滤，收集分子量小于5kDa的胶原肽组分，再用SephadexG-15凝胶柱进行柱层析分离，收集在220nm下有吸收峰的组分，各组分进行ACE抑制活性检测，收集活性最高的组分，经冷冻干燥后即得所述的具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽。3.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性的马面鱼皮胶原肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体过程为：将洗净、绞碎的马面鱼皮与体积浓度为5～15％的脱脂剂按固液重量比1:10～20的比例混合，浸泡脱脂10～20h后过滤除去脱脂剂，用蒸馏水清洗滤渣后，再将该滤渣按固液重量比1:5～10加入质量浓度为7～10％的NaCl溶液中，浸泡12～24h后过滤，所得滤渣用蒸馏水清洗后备用。4.根据权利要求2所述具有ACE抑制活性...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹少谦，戚向阳，马丹妮，赵震震，王正东，杨华，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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