本发明专利技术公开了一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质的专用培养基。本发明专利技术提供的用于SILAC标记的培养基，由无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、重稳定性同位素标记精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶和葡萄糖组成；所述无机盐为硫酸铵、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和硫酸铜。经过实验证明，本发明专利技术开发的一种用于耻垢分枝杆菌SILAC标记的培养基，可以在10代内高效标记耻垢分枝杆菌蛋白，为定量内标的制备和高效精确地定量蛋白质组比较研究创造了条件。
A method of labeling protein of Mycobacterium smegmatis with SILAC and its special medium
【技术实现步骤摘要】
一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质的方法及其专用培养基
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质组的方法及其专用培养基。
技术介绍
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，其流行范围广、危害程度高，是伴随人类历史最长、造成死亡人数最多的一类传染病。2016年，全球新发结核病例1040万，死亡人数超过180万，其中约三分之一是HIV阳性患者。在我国，每年新增病人约130万，死亡人数20万，形势也非常严峻。而耐药性菌株的出现速度有加快的趋势，更是加剧了结核病防诊治的难度。加强对结核致病菌的研究有着重要的临床价值，但结核分枝杆菌属于慢速生长型分枝杆菌，菌落形成要4-5周，且实验需要在P3实验室进行，研究成本较高。耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)是放线菌门(Actinobacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)中的抗酸细菌，具有3.0-5.0μm长的杆状形状，并且可以通过Ziehl-Neelsen方法和金胺-罗丹明荧光法染色，是一种快生长、非致病性分枝杆菌，于1884年由Lustgarten首次发现和分离，并于1899年由莱曼和诺伊曼正式命名。耻垢分枝杆菌主要存在于土壤、水和植物中，已在美国、澳大利亚、俄罗斯、加拿大和瑞士等多个国家发现了分离株。在大多数情况下，耻垢分枝杆菌通常是安全不致病的。与致病分枝杆菌相比，耻垢分枝杆菌仅需要生物安全性1级实验室，易于在大多数实验室常用培养基中培养，且具有生长快速的特点，在3-5天内即可形成肉眼可见的菌落。1990年分离得到的耻垢分枝杆菌MC2155突变株具有极高的质粒转化效率，可以方便地进行遗传操作，构建特定的基因失活和基因报告系统，因而得到了业界的重视。耻垢分枝杆菌基因组已完成测序，长度为6,988,209个核苷酸，具有67％的鸟嘌呤和胞嘧啶含量以及33％的腺嘌呤和胸腺嘧啶含量。耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)具有相同的特殊细胞壁结构，且共有2000多个同源基因，占其编码基因总数的近50％，适于据此调查结核分枝杆菌特定基因的生物学功能。因此耻垢分枝杆菌是研究结核分枝杆菌和其他病原分枝杆菌的重要模式生物。此外，耻垢分枝杆菌木糖的转化效率达70％，因此该菌还可用于发酵法生产食品工业的重要添加剂木糖醇。蛋白质是基因功能的直接执行者，且相互关联，共同完成细胞复杂的生命活动过程。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质，并研究其功能的新兴学科。对耻垢分枝杆菌开展蛋白质组学、特别是定量蛋白质组学研究，发现、鉴别不同条件相关的关键差异蛋白，不仅可以揭示其分子调控网络及其分子机制，还可为探索结核分枝杆菌感染及耐药发生的机理提供线索，为新的结核病预防和治疗技术研发创造条件。目前基于液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)的定量蛋白质组学研究方法主要包括无标记定量和标记定量两种。无标记定量方法根据数据类型可以分为基于鉴定蛋白质肽段数的方法和基于质谱峰强度的方法，操作简单，在高通量大规模蛋白组定量研究中有很大优势。标记定量技术又分为生物标记技术，包括使用重稳定同位素标记氨基酸进行细胞培养的技术(stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture,SILAC)[OngSE,BlagoevB,KratchmarovaI,KristensenDB,SteenH,PandeyA,MannM.Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture,SILAC,asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics.MolCellProteomics.2002May；1(5):376-86.]和同位素亲和标记技术(Isotope-codedaffinitytag,ICAT)[GygiSP,RistB,GerberSA,TurecekF,GelbMH,AebersoldR.Quantitativeanalysisofcomplexproteinmixturesusingisotope-codedaffinitytags.NatBiotechnol.1999Oct；17(10):994-9.]、同位素标记蛋白质标签(isotope-codedproteinlabels,ICPL)[SchmidtA,KellermannJ,LottspeichF.Anovelstrategyforquantitativeproteomicsusingisotope-codedproteinlabels.Proteomics.2005Jan；5(1):4-15.]、同位素标记相对和绝对定量技术(Isobarictagforrelativeabsolutequantitation,iTRAQ)[RossPL,HuangYN,MarcheseJN,WilliamsonB,ParkerK,HattanS,KhainovskiN,PillaiS,DeyS,DanielsS,PurkayasthaS,JuhaszP,MartinS,Bartlet-JonesM,HeF,JacobsonA,PappinDJ.MultiplexedproteinquantitationinSaccharomycescerevisiaeusingamine-reactiveisobarictaggingreagents.MolCellProteomics.2004Dec；3(12):1154-69.Epub2004Sep22.]以及串联质量标签技术(Tandemmasstags,TMT)[ThompsonA,J,KuhnK,KienleS,SchwarzJ,SchmidtG,NeumannT,JohnstoneR,MohammedAK,HamonC.Tandemmasstags:anovelquantificationstrategyforcomparativeanalysisofcomplexproteinmixturesbyMS/MS.AnalChem.2003Apr15；75(8):1895-904.]等化学标记技术。其中SILAC技术采用轻、重同位素型必需氨基酸培养基对细胞进行传代培养。由于待比较蛋白质组样品在培养过程中已经带上标记标签，可在蛋白质组样品制备前进行混合，并经过完全一致的样品处理过程，因此可以最大限度地抵消样品处理过程中引入的实验误差。在液相色谱-质谱联用分析时由于轻重不同标记样品化学性质相同，因此在质谱分离时可以被共洗脱，因此进入质谱前，两者的离子化效率一致，从而实现最高精准度的蛋白质和肽段定量比较，是目前定量蛋白质组学研究的金标准。由于技术和培养条件的限制，早期耻垢分枝杆菌组学水平的蛋白质鉴定主要依靠双向凝胶电泳，难于分清所有蛋白质及其量的变化。作为致病性分枝杆菌——结核分枝杆菌研究的重要非致病性模式生物，耻垢分枝杆菌SILAC标记技术的开发对耻垢分枝杆菌定量蛋白质组学研究及其在基础医学研究乃至发酵产业中的应用具有重要的意义。SI本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于SILAC标记耻垢分枝杆菌的培养基，其特征在于所述培养基组成为：在不含谷氨酸和天冬氨酸的培养耻垢分枝杆菌的基础培养基中添加重稳定性同位素标记赖氨酸和重稳定性同位素标记精氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种用于SILAC标记耻垢分枝杆菌的培养基，其特征在于所述培养基组成为：在不含谷氨酸和天冬氨酸的培养耻垢分枝杆菌的基础培养基中添加重稳定性同位素标记赖氨酸和重稳定性同位素标记精氨酸。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基包括无机盐、组氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、重稳定性同位素标记精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶和葡萄糖；所述无机盐为硫酸铵、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和硫酸铜；所述组氨酸盐酸盐为L-组氨酸盐酸盐；所述异亮氨酸为L-异亮氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸；所述亮氨酸为L-亮氨酸；所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸；所述色氨酸为L-色氨酸；所述丝氨酸为L-丝氨酸；所述重稳定性同位素标记赖氨酸为重稳定性同位素标记L-赖氨酸；所述重稳定性同位素标记精氨酸为重稳定性同位素标记L-精氨酸；所述苏氨酸为L-苏氨酸；所述酪氨酸为L-酪氨酸；所述蛋氨酸为L-蛋氨酸。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述培养基中重稳定性同位素标记的赖氨酸在所述培养基中的终浓度为120mg/L；重稳定性同位素标记的精氨酸在所述培养基中的终浓度为80mg/L。4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于所述培养基中：所述硫酸铵、所述柠檬酸钠、所述磷酸氢二钠、所述磷酸二氢钾、所述柠檬酸铁铵、所述硫酸镁、所述氯化钙、所述硫酸锌、所述硫酸铜、所述葡萄糖、所述L-组氨酸盐酸盐、所述L-异亮氨酸、所述L-缬氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-丝氨酸、所述重稳定性同位素标记的L-赖氨酸、所述重稳定性标记的L-精氨酸、所述L-苏氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸盐和所述尿嘧啶的质量比为500：100：2500：1000：40：50：0.5：1：1：2000：20：30：150：30：50：20：400：120：80：200：30：20：20：20。5.根据权利要求1-3中任一...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐平，张俊令，王富强，张瑶，李衍常，常蕾，高慧英，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。