从头合成的核酸文库制造技术

本文公开了用于生成编码gRNA序列的寡核酸文库的方法。通过本文所述方法编码的gRNA可以是单gRNA序列或双gRNA序列。所述方法提供了以改善的准确性和均匀性生成gRNA文库作为DNA前体或作为RNA转录产物。

Ab initio synthesis of nucleic acid libraries

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从头合成的核酸文库交叉引用本申请要求于2016年11月9日提交的美国临时申请号62/419,881、于2016年10月21日提交的美国临时申请号62/411,388、于2016年9月13日提交的美国临时申请号62/393,948、于2016年8月31日提交的美国临时申请号62/382,191以及于2016年8月22日提交的美国临时申请号62/378,134的权益，这些申请各自通过引用以其全文并入本文。序列表本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且其通过引用以其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2017年4月4日，命名为44854-727_601_SL.txt，并且大小为13,567字节。专利技术背景合成生物学的基石是设计、构建和测试过程，是需要待产生的DNA能够快速且可行地生成并优化这些定制途径和生物体的迭代过程。在设计阶段，构成DNA的A、C、T和G核苷酸被规划成将包含感兴趣区域的多种序列，每种序列变体代表将进行测试的特定假设。这些变体序列代表序列空间的子集，序列空间这一概念起源于进化生物学，并且适合于构成基因、基因组、转录组和蛋白质组的全部序列。在靶向基因组编辑的背景下，需要快速生成高度准确和均匀的核酸文库，以供特异性地指导基因、基因簇、途径或整个基因组的酶促编辑。援引并入本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用以其全文并入。
技术实现思路
本文提供了用于有效从头合成和筛选高度准确的核酸文库的系统、方法和组合物。如本文所述的核酸文库包含用于特异性靶向和编辑基因、基因簇、生物途径或整个基因组的核酸。本文提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少500个不相同的DNA分子，其中每个不相同的DNA分子编码不同的gRNA序列，并且其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的DNA分子具有约20％至约85％的GC碱基含量。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的DNA分子具有约30％至约70％的GC碱基含量。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少约90％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少99％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包括至少2000个不相同的DNA分子。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包括至少3500个不相同的DNA分子。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包括至少100,000个不相同的DNA分子。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的DNA分子在长度上包含至多200个碱基。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的DNA分子在长度上包含约100至约200个碱基。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包含编码靶向生物途径中的基因的gRNA序列的不相同的DNA分子。本文提供了核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包含编码靶向整个基因组中的基因的gRNA序列的不相同的DNA分子。本文提供了核酸文库，其中所述gRNA是单gRNA或双gRNA。本文提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少2000个不相同的核酸，其中每个不相同的核酸编码不同的sgRNA序列，其中每个sgRNA序列包含与真核基因互补的靶向结构域，并且其中所述至少2000个不相同的核酸中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同的核酸的平均频率的2倍以内的量存在于所述核酸文库中。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的核酸具有约20％至约85％的GC碱基含量。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的核酸具有约30％至约70％的GC碱基含量。本文提供了核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸中的至少约90％以所述文库中每个所述不相同的核酸的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。本文提供了核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸中的至少99％以所述文库中每个所述不相同的核酸的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的核酸在长度上包含至多200个碱基。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的核酸在长度上包含约100至约200个碱基。本文提供了核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸包含编码靶向生物途径中的基因的sgRNA序列的不相同的核酸。本文提供了核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸包含编码靶向整个基因组中的基因的sgRNA序列的不相同的核酸。本文提供了核酸文库，其中每个不相同的核酸包括DNA或RNA分子。本文提供了扩增子文库，其中所述扩增子文库包含多个不相同的DNA分子，其中每个不相同的DNA分子存在于扩增产物群体中，其中每个不相同的DNA分子编码不同的gRNA序列，并且其中所述多个不相同的DNA分子中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同DNA分子的平均频率的2倍以内的量各自存在于所述扩增子文库中。本文提供了扩增子文库，其中每个不相同的DNA分子具有约30％至约70％的GC碱基含量。本文提供了扩增子文库，其中所述gRNA是单gRNA或双gRNA。本文提供了细胞文库，其中所述细胞文库包含多个细胞群体，其中每个所述细胞群体包含编码不同gRNA序列的DNA分子，其中每个gRNA序列包含用于与基因结合的靶向区域，并且其中所述细胞群体中的至少15％在所述基因的表达方面具有至少2倍的消耗。本文提供了细胞文库，其中所述细胞群体中的至少45％在所述基因的表达方面具有至少2倍的消耗。本文提供了细胞文库，其中所述gRNA是单gRNA或双gRNA。本文提供了细胞文库，其中所述多个细胞群体包含编码每个单个基因至少3个不同gRNA序列的DNA分子。本文提供了细胞文库，其中所述多个细胞群体包含编码每个单个基因至少5个不同gRNA序列的DNA分子。本文提供了细胞文库，其中所述多个细胞群体包含至少2000个细胞群体。本文提供了细胞文库，其中所述多个细胞群体包含编码生物途径中的gRNA序列的DNA分子。本文提供了细胞文库，其中所述多个细胞群体包含编码整个基因组中的gRNA序列的DNA分子。本文提供了细胞文库，其中所述基因组是拟南芥(Arabidopsisthaliana)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、家犬(Canislupusfamiliaris)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、斑马鱼(Daniorerio)、盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、智人(Homosapiens)、猕猴(Macacamulatta)、小家鼠(Musmusculus)、穴兔(O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸文库，其中所述核酸文库包含至少500个不相同的DNA分子，其中每个不相同的DNA分子编码不同的gRNA序列，并且其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.22 US 62/378,134;2016.08.31 US 62/382,191;1.一种核酸文库，其中所述核酸文库包含至少500个不相同的DNA分子，其中每个不相同的DNA分子编码不同的gRNA序列，并且其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。2.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个不相同的DNA分子具有约20％至约85％的GC碱基含量。3.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个不相同的DNA分子具有约30％至约70％的GC碱基含量。4.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少约90％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。5.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子中的至少99％以所述文库中每个所述不相同的DNA分子的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。6.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包括至少2000个不相同的DNA分子。7.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包括至少3500个不相同的DNA分子。8.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包括至少100,000个不相同的DNA分子。9.根据权利要求1所述的核酸文库，其中每个不相同的DNA分子在长度上包含至多200个碱基。10.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸文库，其中每个不相同的DNA分子在长度上包含约100至约200个碱基。11.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包含编码靶向生物途径中的基因的gRNA序列的不相同的DNA分子。12.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述至少500个不相同的DNA分子包含编码靶向整个基因组中的基因的gRNA序列的不相同的DNA分子。13.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述gRNA是单gRNA或双gRNA。14.一种核酸文库，其中所述核酸文库包含至少2000个不相同的核酸，其中每个不相同的核酸编码不同的sgRNA序列，其中每个sgRNA序列包含与真核基因互补的靶向结构域，并且其中所述至少2000个不相同的核酸中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同的核酸的平均频率的2倍以内的量存在于所述核酸文库中。15.根据权利要求14所述的核酸文库，其中每个不相同的核酸具有约20％至约85％的GC碱基含量。16.根据权利要求14所述的核酸文库，其中每个不相同的核酸具有约30％至约70％的GC碱基含量。17.根据权利要求14所述的核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸中的至少约90％以所述文库中每个所述不相同的核酸的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。18.根据权利要求14至16中任一项所述的核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸中的至少99％以所述文库中每个所述不相同的核酸的所述平均频率的2倍以内的量各自存在于所述核酸文库中。19.根据权利要求14所述的核酸文库，其中每个不相同的核酸在长度上包含至多200个碱基。20.根据权利要求14至18中任一项所述的核酸文库，其中每个不相同的核酸在长度上包含约100至约200个碱基。21.根据权利要求14所述的核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸包含编码靶向生物途径中的基因的sgRNA序列的不相同的核酸。22.根据权利要求14所述的核酸文库，其中所述至少2000个不相同的核酸包含编码靶向整个基因组中的基因的sgRNA序列的不相同的核酸。23.根据权利要求14所述的核酸文库，其中每个不相同的核酸包括DNA或RNA分子。24.一种扩增子文库，其中所述扩增子文库包含多个不相同的DNA分子，其中每个不相同的DNA分子存在于扩增产物群体中，其中每个不相同的DNA分子编码不同的gRNA序列，并且其中所述多个不相同的DNA分子中的至少约80％以所述文库中每个所述不相同DNA分子的平均频率的2倍以内的量各自存在于所述扩增子文库中。25.根据权利要求24所述的扩增子文库，其中每个不相同的DNA分子具有约30％至约70％的GC碱基含量。26.根据权利要求24所述的扩增子文库，其中所述gRNA是单gRNA或双gRNA。27.一种细胞文库，其中所述细胞文库包含多个细胞群体，其中每个所述细胞群体包含编码不同gRNA序列的DNA分子，其中每个gRNA序列包含用于与基因结合的靶向区域，并且其中所述细胞群体中的至少15％在所述基因的表达方面具有至少2倍的消耗...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·考克斯，陈思远，
申请(专利权)人：特韦斯特生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US