一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β‑葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。本发明专利技术还公开了所述工程菌株在发酵生产纤维素酶中的应用，实验证实该工程菌株的egl2的表达量较出发菌株提高了27倍，而bgl1的表达量则提高了410倍，内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖甘酶活力分别为117.5IU/mL和34.5IU/mL。其发酵生产纤维素酶系可以高效应用于玉米芯以及其他木质纤维素酶材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。

A Trichoderma reesei engineering strain with double high secretion of endoglucanase and beta-glucosidase and its construction method and Application

The present invention discloses a Trichoderma reesei QMEB5 genetically engineered strain with high secretion of endoglucanase and beta-glucosidase. The strain is QM9414 Eegl2 Ebgl1, a fusion gene expression vector pTeg2 containing endoglucanase 2 gene expression box is transformed from Trichoderma reesei, and then transformed into a fusion gene expression vector containing beta-glucanase. The plasmid pTHB of glucosidase gene expression box was screened and validated. The present invention also discloses the application of the engineering strain in cellulase production by fermentation. Experiments show that the egl2 expression level of the engineering strain is 27 times higher than that of the original strain, while the expression level of bgl1 is 410 times higher. The activities of endoglucanase and beta-glucomannase are 117.5 IU/mL and 34.5 IU/mL, respectively. Its fermentation cellulase system can be used to degrade corn cob and other lignocellulase materials efficiently. It has good industrial development and application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程

技术介绍
生物质是地球上储量最为丰富的可再生资源。将复杂的生物质酶促水解成可发酵糖进而转化为生物燃料和化学品已成为克服能源危机的有效途径。但是，过高的纤维素酶用酶成本制约了纤维素能源的工业大规模生产。纤维素酶生产效率低、酶的比活力不强及酶组分比例不适合等问题是酶成本过高的主要因素。因此，为了解决该瓶颈问题，一方面需要从菌株本身角度考虑，提高菌株的纤维素酶生产能力；另一方面需要结合基因工程策略优化纤维素酶系的组成以增加其催化效率。将纤维素转化为可发酵糖的过程需要多种酶组分的参与。这些酶包括外切葡聚糖酶(CBHs)，内切葡聚糖酶(EGs)和β-葡萄糖苷酶(BGLs)。CBHs沿纤维素链滑动，并从纤维素链的两端切除纤维二糖；而EG在纤维素链内随机水解糖苷键，生成纤维寡糖；随后，BGL将产生寡糖和纤维二糖转化为葡萄糖；三者协同水解纤维素。各种酶组分之间的协同效应使得纤维素酶系的酶活力远高于单组分酶的总活力。单个酶的性质以及在酶系中所占的比例影响了纤维素酶系的催化效率。通过调整纤维素酶系中单酶组分的比例已成为优化纤维素酶系的重要策略。基于主要酶组分的复配纤维素酶系已经显示出在各种纤维素底物的水解中接近甚至超过商业纤维素酶的性能。例如，仅用三种主要纤维素酶(CBH1，CBH2和EG1)体外复配的最小酶系可以达到用商业酶制剂获得的纤维素水解率的80.0％。然而，单个纯化的酶组分制备是繁琐且昂贵的，因此阻碍了体外优化的工业应用。因此，利用基因工程策略体内设计和优化纤维素酶系具有重要工业应用价值和理论指导意义。丝状真菌里氏木霉是目前商业纤维素酶制剂得主要生产菌株(Trichodermareesei)，且能够分泌木质纤维素完全水解所必需的所有核心酶。这些降解酶包括两个CBHs(CBH1和CBH2)、至少四个EGs(EG1，EG2，EG3和EG5)以及BGL1，它们以协同方式起作用以降解纤维素材料。EG1和EG2是里氏木霉两种主要的内切酶，EG的蛋白量占分泌蛋白总量的20％。虽然EG2的比活力是EG1的两倍，但其蛋白分泌量要远低于EG1。因此，EG2是重要的纤维素酶优化靶点。另外，长期以来一直认为BGL不足导致纤维素水解过程中纤维二糖的积累，从而抑制了外切酶的活力，进而导致整个纤维酶系催化效率的降低。因此，BGL1是另一个重要的改造靶点。尽管通过增加单一酶组分比例能够适度的改良纤维素系。然而，仅增加单组分比例并不能达到最优的纤维素酶的催化效率，因此，需要对多酶组分进行复配和设计。迄今为止，国内外尚无利用基因工程优化里氏木霉内源多酶组分以提高纤维素酶系催化效率的报道，更未见有关内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用的报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用。本专利技术所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，其特征在于：所述工程菌株命名为里氏木霉(Trichodermareesei)QMEB5，该菌株基因组中含有多拷贝内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1，其基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β-葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。上述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，步骤是：将内切葡聚糖酶2的基因(egl2)表达盒与pMD19-T载体连接，得到融合基因表达载体pTeg2；再将该载体转化进出发菌里氏木霉QM9414的基因组，即获得内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株；随后将含有β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)表达盒的质粒pTHB，转化入内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株的基因组中，筛选、验证即可获得内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌QMEB5；其中，所述egl2基因其上游为内切葡聚糖酶2启动子Peg2，下游为内切葡聚糖酶2终止子Teg2；bgl1基因其上游为外切葡聚糖酶1启动子Pcbh1，下游为外切葡聚糖酶1终止子Tcbh1；所述egl2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述bgl1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法中，所述的内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1优选来自里氏木霉RUT-C30基因组；所述的eg2的启动子Peg2和终止子Teg2优选来源于里氏木霉QM9414；所述的bgl1基因的启动子Pcbh1和终止子Tcbh1优选来源于质粒PTHB。本专利技术所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌在发酵生产纤维素酶中的应用。上述应用中，所述发酵生产纤维素酶的方法是：将基因工程菌株里氏木霉(Trichodermareesei)QMEB5接种到装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤、收集湿菌丝，再按0.5-1g湿菌丝转接到100mL发酵培养基的比例扩大接种，继续培养120-168h，然后以9000-13000rpm，4℃离心5-10min收集上清液，即得到含纤维素酶的酶液；其中，所述种子培养基的组成成分为：葡萄糖10g/L，玉米粉15g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO415g/L，MgSO41g/L，CaCl20.6g/L；所述发酵培养基的组成成分为：结晶纤维40g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO4，5g/L，KH2PO45g/L，MgSO41g/L，CaCl20.6g/L，CaCO32.5g/L，甘油2.5g/L，Tween-802g/L。本专利技术所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌发酵产生酶液在水解玉米芯材料中的应用。本专利技术公开了一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用。较现有技术中的里氏木霉QM9414比，本专利技术的里氏木霉工程菌QMEB5具有以下突出效果：本专利技术所述的里氏木霉菌株QMEB5较出发菌株具有更强的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶分泌能力，实验证实该工程菌株的egl2的表达量较出发菌株提高了27倍，而bgl1的表达量则提高了410倍，其滤纸酶活力为10.3IU/mL，内切葡聚糖酶活力117.5IU/mL,外切葡聚糖酶酶活力4.5IU/mL，葡萄糖苷酶活力34.5IU/mL。与出发菌株相比分别提高2.38倍、3.8倍、2.3倍和27.8倍。另外，利用本专利技术的里氏木霉工程菌QMEB5所生产的纤维素酶系处理玉米芯材料时，与出发株相比，葡萄糖得率提高了2.81倍；在水解玉米芯材料40h时，其纤维素转化率能够到达95％，显著高于出发菌株(33％)。本专利技术提供的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，其特征在于：所述工程菌株命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因组中含有多拷贝内切葡聚糖酶编码基因egl2和β‑葡萄糖苷酶编码基因bgl1，其基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β‑葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。

【技术特征摘要】
1.一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，其特征在于：所述工程菌株命名为里氏木霉(Trichodermareesei)QMEB5，该菌株基因组中含有多拷贝内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1，其基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β-葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。2.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，步骤是：将内切葡聚糖酶2的基因(egl2)表达盒与pMD19-T载体连接，得到融合基因表达载体pTeg2；再将该载体转化进出发菌里氏木霉QM9414的基因组，即获得内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株；随后将含有β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)表达盒的质粒pTHB，转化入内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株的基因组中，筛选、验证即可获得内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌QMEB5；其中，所述egl2基因其上游为内切葡聚糖酶2启动子Peg2，下游为内切葡聚糖酶2终止子Teg2；bgl1基因其上游为外切葡聚糖酶1启动子Pcbh1，下游为外切葡聚糖酶1终止子Tcbh1；所述egl2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述bgl1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.根据权利要求2所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的内切葡聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟耀华，钟立霞，钱远超，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37