一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术通过Tlrgt2基因上下游同源臂序列、潮霉素抗性基因hph序列构建Tlrgt2敲除载体，采用基因敲除的方法制备得到ΔTlrgt2木霉工程菌株，敲除Tlrgt2基因，可以有效地提高菌株的peptaibols抗菌肽生产能力。本发明专利技术构建的ΔTlrgt2木霉工程菌可以稳定传代，并能够显著提高木霉peptaibols抗菌肽的产量，ΔTlrgt2木霉工程菌peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍，因此本发明专利技术有助于木霉peptaibols抗菌肽在医药和农业上的应用。

【技术实现步骤摘要】
一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程

技术介绍
木霉(Trichodermaspp.)是一类重要的真菌资源，广泛存在于土壤、腐木、根际及叶际环境。木霉不仅是工业上重要的酶制剂生产菌株，在农业生产中也是重要的生防因子和植物促生因子。木霉的生防作用机制主要包括以下几个方面：(1)重寄生作用：木霉能够识别寄主真菌，不仅附着缠绕在寄主菌丝上，还产生多种胞外酶溶解寄主细胞壁，穿透菌丝吸收营养；(2)抗生作用：木霉能够产生多种次级代谢产物抑制植物病原微生物的生长，包括peptaibols，tricholin，6-penthyl-α-pyrone，viridin等；(3)竞争作用：木霉一般生长繁殖较快，适应性强，能够更高效的利用空间内的营养成分；(4)诱导抗性的作用：木霉能够诱导植物抗性的产生，激发植物的防御机制，从而抑制植物病害的发生。目前，木霉被用于防治由立枯丝核菌、腐霉菌、镰刀菌等引起的棉花、人参、三七等幼苗立枯病以及茉莉、花生和辣椒的白绢病、番茄的猝倒病等。木霉还可以有效降低灰霉引起的藤蔓和采后果实的腐烂病。木霉不仅能够拮抗病原微生物保护植物免受病害侵扰，还能产生多种次级代谢产物促进植物的生长发育。木霉产生的peptaibols类次级代谢产物是由非核糖体肽合成酶控制合成的特殊的肽类抗生素，其含有高比例的非蛋白质氨基酸残基，尤其是α-氨基异丁酸，氮端通常烷基化，碳端羟基化，含有5～20个氨基酸残基，多数为15～20个氨基酸残基。peptaibols类抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤及诱导植物产生抗性等多种生物学活性。Peptaibols类抗菌肽对多种植物病原微生物具有广谱的抗菌活性，并能抑制植物病害的发生，因此可用作生防制剂，防治植物病害的发生，从而减少化学农药的使用，保护环境。Peptaibols类抗菌肽还能通过激活Ca2+信号转导途径引起肝癌细胞系HepG2的凋亡和自噬，具有新型抗肿瘤药物的潜力。因此，peptaibols类次级代谢产物在农业和医药领域都具有很好的应用潜力。Peptaibols抗菌肽含有大量的非蛋白源的氨基酸残基，不能采用现有的多肽化学合成方法生产，因此生物合成是其主要的生产方法。中国专利文献CN105950691A公开了一种peptaibols类抗菌肽及其制备方法和应用，该方法将橘绿木霉发酵培养得到发酵液，再通过树脂吸附、溶剂萃取、以及减压浓缩等工艺获得peptaibols类抗菌肽，培养得到的发酵液中抗菌肽的含量仅为0.24％。2007年宋晓妍等人报道了康宁木霉菌(T.koningiiSMF2)用固体培养方式培养3天产生Peptaibols，每公斤培养基仅能产生146.20毫克的TrichokoninIV。现有技术中，无论是液体发酵还是固体发酵，都存在产量较低的问题，而且缺乏高效的生产菌株。Sigmaaldrich公司的Alamethicin是仅有的商品化peptaibols抗菌肽，但价格昂贵，无法满足peptaibols抗菌肽在农业和医药领域的应用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一株高产Peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌及其构建方法与应用，本专利技术构建的ΔTlrgt2木霉工程菌能够显著提高peptaibols抗菌肽的产量，peptaibols抗菌肽产量比出发菌株提高约12倍。术语说明：Peptaibols抗菌肽：是指一类由非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成的富含α-氨基异丁酸(Aib)、具有烷基化的N-末端和羟基化的C-末端、具有α-螺旋线性结构、对多种细菌和真菌等具有拮抗作用的一类特殊的肽类抗生素的总称。本专利技术的技术方案如下：一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌的构建方法，步骤如下：(1)提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列，所述upF、upR、downF、downR的引物序列如下：upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGCupR：CTTCAATATCATCTTCTGTCGACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCGdownF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCAdownR：TTCAATTCTTTGTTCGCTCCTGGT(2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列，所述hphF、hphR的引物序列如下：hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAGhphR：CATACCCACGCCGAAACAAG(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列经纯化后，按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，得融合PCR产物；(4)以步骤(3)得到的融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物经PCR扩增得ΔTlrgt2敲除载体，所述CF、CR的引物序列如下：CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAGCR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG(5)将步骤(4)得到的ΔTlrgt2敲除载体转化木霉SMF2原生质体，经再生、筛选及验证，得高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述提取木霉SMF2的基因组DNA参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TMFungalDNAMiniKit，OMEGA)说明书进行。根据本专利技术优选的，步骤(1)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStartFastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH2O补足50μL；所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。根据本专利技术优选的，步骤(2)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStartFastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH2O补足50μL；所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。根据本专利技术优选的，步骤(3)中所述纯化是将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后即得纯化产物，其中胶回收采用DNA回收试剂盒(OMEGA)。根据本专利技术优选的，步骤(3)中所述融合PCR扩增体系为：上游同源臂序列1μL，下游同源臂序列1μL，hph序列2.5μL，dNTP混合物2μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌的构建方法，步骤如下：(1)提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列，所述upF、upR、downF、downR的引物序列如下：upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGCupR：CTTCAATATCATCTTCTGTCGACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCGdownF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCAdownR：TTCAATTCTT TGTTCGCTCC TGGT(2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列，所述hphF、hphR的引物序列如下：hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAGhphR：CATACCCACGCCGAAACAAG(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列经纯化后，按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，得融合PCR产物；(4)以步骤(3)得到的融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物经PCR扩增得ΔTlrgt2敲除载体，所述CF、CR的引物序列如下：CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAGCR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG(5)将步骤(4)得到的ΔTlrgt2敲除载体转化木霉SMF2原生质体，经再生、筛选及验证，得高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。...

【技术特征摘要】
1.一株高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌的构建方法，步骤如下：(1)提取木霉SMF2的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，以upF、upR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因上游同源臂序列，以downF、downR为上下游引物经PCR扩增得Tlrgt2基因下游同源臂序列，所述upF、upR、downF、downR的引物序列如下：upF：TGATTAGCCAGCCAGAGCAGCupR：CTTCAATATCATCTTCTGTCGACTGTTGCTCTCCTACCTCTCCGdownF：CTTGTTTCGGCGTGGGTATGATGTCGCTGTTGCCCGTACCAdownR：TTCAATTCTTTGTTCGCTCCTGGT(2)以质粒pUCATPH为模板，以hphF、hphR为上下游引物经PCR扩增得潮霉素抗性基因hph序列，所述hphF、hphR的引物序列如下：hphF：GTCGACAGAAGATGATATTGAAGhphR：CATACCCACGCCGAAACAAG(3)将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列经纯化后，按照摩尔比1:1:3进行融合PCR扩增，得融合PCR产物；(4)以步骤(3)得到的融合PCR产物为模板，以CF、CR为上下游引物经PCR扩增得ΔTlrgt2敲除载体，所述CF、CR的引物序列如下：CF：GGTCCTCGTTCTCCATCTTCAGCR：TGTTGCTCTCCTACCTCTCCG(5)将步骤(4)得到的ΔTlrgt2敲除载体转化木霉SMF2原生质体，经再生、筛选及验证，得高产peptaibols抗菌肽的ΔTlrgt2木霉工程菌。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中所述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA1μL，dNTP混合物5μL，5×TransStartFastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH2O补足50μL；步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中所述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃终延伸10min。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述纯化是将步骤(1)和步骤(2)扩增得到的上游同源臂序列、下游同源臂序列、hph序列产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收后即得纯化产物。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述融合PCR扩增体系为：上游同源臂序列1μL，下游同源臂序列1μL，hph序列2.5μL，dNTP混合物2μL，5×TransStartFastPfu缓冲液4μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶0.5μL，ddH2O补足20μL；所述融合PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；95℃变性30sec，53℃退火6min，72℃延伸4min，16个循环；72℃终延伸10min。5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述木霉SMF2原生质体的制备步骤如下：将木霉SMF2的孢子接种于菌丝生长培养基中，28℃、160rpm培养13.5h；将菌丝培养物4000rpm离心5min，用0.7MNaCl溶液洗涤沉淀三次，每次25mL，加入细胞壁裂解酶液，重悬，30℃、60rpm酶解2.5～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，陈秀兰，周燕蓉，宋晓妍，张熙颖，解彬彬，苏海楠，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37