一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一株组成型高产Sorbicillinoids里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用，该里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018385，保藏日期为2018年06月20日。该菌株ZC121是在里氏木霉Rut‑C30中敲除基因121121发生脱靶效应得到，可用于生产大量Sorbicillinoids。

A Trichoderma reesei genetically engineered strain and its preparation method and Application

The invention discloses a constitutive high-yield Sorbicillinoids Trichoderma reesei gene engineering strain and its preparation method and application. The Trichoderma reesei gene engineering strain is classified as Penicillium filamentous fungus of Moniliales. The strain ZC121 has been preserved in a typical culture preservation center in China and the preservation number is C. CTCC M 2018385, the date of preservation is June 20, 2018. The strain ZC121 was obtained from Trichoderma reesei Rut_C30 by knocking out the gene 121121, which could be used to produce large quantities of Sorbicillinoids.

【技术实现步骤摘要】
一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株组成型高产Sorbicillinoids里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
Sorbicillinoids通常也被称作黄色色素，来源于聚酮类化合物及一些在羧基末端具有环化结构的己酮类次级代谢产物，通常由一些海洋或陆地的丝状真菌产生，比如：木霉属(ApplEnvironMicrobio.2016；82:6247-57)、曲霉属(MicrobiolRes.2010；165:516-22)、青霉属(Tetrahedron.2005；61:7252-65)、链霉菌属(ProcNatlAcadSciUSA.2001；98:12215-20)、支顶孢属(TetrahedronLett.1994；35:2577-80)、拟青霉属(TetrahedronLett.2008；49:654-57)，这些化合物大部分具有复杂的、高度氧化的C1-C6山梨酰基侧链和两个或三个循环结构。基于这样的结构，Sorbicillinoids类化合物可以分成四类：单体类的Sorbicillinoids,，双元的BiSorbicillinoids，三元的TriSorbicillinoids和杂合的Sorbicillinoids。它们具有多种生物活性，包括抗癌(JNatProd.2010；73:969-71)、抗氧化(ChemCommun.2002；662-3)、抗病毒(JNatProd.2014；77:424-8)、抗菌作用(JNatProd.2005；68:865-70)，显示出了在农业、医药和食品工业上的重要应用。因此，虽然这些物质最开始在真菌发酵生产β-lactams(ApplEnviro.Microbiol.2016；82:3971-78)和纤维素酶(ApplEnvironMicrobio.2016；82:6247-57)时希望被去除，但是这些黄色色素类物质仍吸引了人们极大的兴趣。关于Sorbicillinoids的研究主要集中在里氏木霉和青霉菌。里氏木霉作为工业上生产纤维素酶、半纤维素酶以及其他重组蛋白的主要工业化菌株(TrendsBiotechnol.2016；34:970-82)，它同时也能够产生丰富的次级代谢产物(Microbiology.2012；158:35-45),但是却很少引起人们注意。人们观察到里氏木霉在生长过程中会产生黄色色素(EurJBiochem.1996；235:248-55),随后这些黄色物质被鉴定为Sorbicillin，Sorbicillinol和Soribicilloinds的混合物(FrontMicrobiol.2017；8.TechnicalUniversityofDenmark.2013；164.ApplEnvironMicrobio.2016；82:6247-57)。人们猜测在产黄青霉(MicrobBiotechnol.2017；10:958-68)和里氏木霉(FrontMicrobiol.2017；8)的产Sorbicillinoids类物质的合成路径中，所有基因和次级代谢中所涉及到的基因一样在基因组上是聚成簇的(Microbiol.2016；82:3971-78)。该基因簇也包含两个转录调节因子YPR1和YRP2以及一个转运因子(ApplEnvironMicrobio.2016；82:6247-57)。然而，Sorbicillinoids类物质的合成仍然不是很清楚，并且也缺少提高Sorbicillinoids产量的相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有Sorbicillinoids产量低，且产量受培养条件影响严重的技术问题，提供一种里氏木霉基因工程菌ZC121，是在里氏木霉Rut-C30中敲除基因121121发生脱靶效应得到，菌株ZC121可用于生产大量Sorbicillinoids。一种里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目(Moniliales)木霉属(Penicillium)丝状真菌里氏木霉(Trichodermareesei)，菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学，邮编为430072，保藏编号为CCTCCM2018385，保藏日期为2018年06月20日。上述里氏木霉基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：步骤1，提取里氏木霉RUT-C30的RNA并进行反转录获得cDNA；步骤2，以里氏木霉RUT-C30的cDNA为模版设计基因121121敲除的上下游同源臂引物，进行PCR扩增；步骤3，将步骤2的PCR扩增产物采用同源重组的方法插入质粒的XhoI和BamHI酶切位点中，得到重组质粒pXBthg-121121；步骤4，将步骤3中得到的重组质粒pXBthg-121121转入里氏木霉RUT-C30的孢子中，筛选获得稳定遗传的转化子，即为里氏木霉基因工程菌ZC121。筛选得到稳定遗传的转化子的方法具体为：将重组质粒pXBthg-121121导入里氏木霉RUT-C30的孢子后，在筛选培养基中培养5天得到转化子，再将转化子进行3轮稳定的传代培养，即得稳定遗传的转化子。对获得的稳定遗传的转化子进行3轮稳定的传代培养以使得pXBthg-121121在转化子中稳定地过表达，之后对转化子的培养液进行Sorbicillinoids产量的检测，结果显示，菌株ZC121-1在各种碳源、pH4-7、温度18-42℃、光照或不光照条件下都能高产Sorbicillinoids，表现出组成型高产。进一步地，基因121121基因敲除盒的序列如SEQIDNo.1所示。进一步地，基因121121敲除的上下游同源臂引物为：上游同源序列的上游引物序列如SEQIDNo.2所示、下游引物序列如SEQIDNo.3所示；下游同源序列的上游引物序列如SEQIDNo.4所示、下游引物序列如SEQIDNo.5所示。进一步地，步骤3中采用的质粒为pxBthg。上述里氏木霉基因工程菌在生产Sobicillinoids的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：1、本专利技术利用同源重组技术所构建的里氏木霉基因工程菌ZC121能组成型高产Sorbicillinoids。在分别以纤维素、乳糖、葡萄糖、半乳糖和甘油为碳源时，ZC121所产的黄色色素分别是RUT-C30的5.1倍、8.4倍、4.3倍、5.1倍和4.5倍。2、里氏木霉基因工程菌ZC121高产Sorbicillinoids的过程具有很高的鲁棒性。菌株ZC121在pH4-7，温度18-42℃，和不同光照条件下(全光照、不光照或全暗)都能高产Sorbicillinoids。3、与已有文献相比，里氏木霉基因工程菌ZC121的Sorbicillinoids产量是最高的。附图说明图1为实施例1中pXBthg-121121重组质粒图谱。图2为实施例1中不同转化子的Sorbicillinoids产量。图3为实施例2中不同碳源条件下菌株ZC121和RUT-C30的Sorbicillinoids产量。图4为实施例3中葡萄糖条件下菌株ZC121在不同温度条件下的Sorbicillinoids产量。图5为实施例4中葡萄糖条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018385，保藏日期为2018年06月20日。

【技术特征摘要】
1.一种里氏木霉基因工程菌，其分类命名为丛梗孢目（Moniliales）木霉属（Penicillium）丝状真菌里氏木霉（Trichodermareesei），菌株号ZC121，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2018385，保藏日期为2018年06月20日。2.权利要求1所述的里氏木霉基因工程菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，提取里氏木霉RUT-C30的RNA并进行反转录获得cDNA；步骤2，以里氏木霉RUT-C30的cDNA为模版设计基因121121敲除的上下游同源臂引物，进行PCR扩增；步骤3，将步骤2的PCR扩增产物采用同源重组的方法插入质粒的XhoI和BamHI酶切位点中，得到重组质粒pXBthg-121121；步骤4，将步骤3中得到的重组质粒pXBt...

【专利技术属性】
技术研发人员：林凤鸣，李程程，杨子华源，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32