在不存在诱导底物下丝状真菌细胞中的蛋白产生制造技术

本公开的某些实施例针对变体丝状真菌细胞、其组合物及其用于增加一种或多种目的蛋白的产生的方法。更特别地，在某些实施例中，本公开针对衍生自亲本丝状真菌细胞的变体丝状真菌(宿主)细胞，其中所述变体宿主细胞包含遗传修饰，所述遗传修饰使得能够在不存在诱导底物的情况下表达/产生目的蛋白(POI)。在某些实施例中，本公开的变体真菌宿主细胞包含遗传修饰，所述遗传修饰增加编码本文称为Ace3‑L的Ace3蛋白的纤维素酶表达激活子3(ace3)基因变体的表达。

Protein production in filamentous fungal cells without induced substrates

Some embodiments of the present disclosure are directed at variant filamentous fungal cells, their compositions, and methods for increasing the production of one or more target proteins. More specifically, in some embodiments, the present disclosure is directed at variant filamentous fungi (host) cells derived from parental filamentous fungal cells, where variant host cells contain genetic modifications that enable expression/production of a target protein (POI) without an inducing substrate. In some embodiments, the mutant fungal host cells of the present disclosure contain genetic modifications that increase the expression of cellulase expression activator 3 (ace3) gene variants encoding Ace3 L protein herein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在不存在诱导底物下丝状真菌细胞中的蛋白产生相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月04日提交的美国临时申请号62/403,787的权益，该临时申请通过引用以其全文特此结合。序列表经由EFS同此提交的序列表文本文件包含于2017年10月02日创建的文件“NB41159WOPCT_SEQLISTING.txt”，其大小为157千字节。本序列表符合37C.F.R.§1.52(e)，并以其全文通过引用结合在此。
本公开总体涉及分子生物学、生物化学、蛋白产生和丝状真菌的领域。本公开的某些实施例针对变体丝状真菌细胞、其组合物及其用于增加一种或多种目的蛋白的产生的方法。更特别地，在某些实施例中，本公开针对衍生自亲本丝状真菌细胞的变体丝状真菌(宿主)细胞，其中所述变体宿主细胞包含遗传修饰，该遗传修饰使得能够在不存在诱导底物的情况下表达/产生一种或多种目的蛋白(POI)。
技术介绍
纤维素(木质纤维素植物材料的组分)是自然界中发现的最丰富的多糖。同样，本领域已知丝状真菌是植物生物质的有效降解物，并且实际上是工业上相关的木质纤维素降解酶(下文统称为“纤维素酶”的酶)的主要来源。例如，已知丝状真菌产生细胞外纤维素酶(例如，纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶)，其水解纤维素的β-(1,4)-连接的糖苷键以产生葡萄糖(即，因此赋予这些丝状真菌利用纤维素生长的能力)。特别地，已知丝状真菌里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)；真菌红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性型)是纤维素酶的有效产生者(参见，例如，PCT国际申请号WO1998/15619、WO2005/028636、WO2006/074005、WO1992/06221、WO1992/06209、WO1992/06183、WO2002/12465等)。因此，已经利用如里氏木霉的丝状真菌产生酶的能力，所述酶在如纤维素衍生的乙醇、纺织品和衣服、洗涤剂、纤维、食品和饲料添加剂以及其他工业用途的商品的生产中是有价值的。已知这些工业上相关的酶在木霉属(Trichoderma)中的表达(和产生)取决于可用于生长的碳源。更特别地，丝状真菌产生纤维素酶是耗能的过程，因此，诱导和抑制机制都在丝状真菌中进化以确保这些酶的有效产生。例如，编码植物细胞壁材料降解所需酶(即纤维素酶/半纤维素酶)的各种基因在“诱导”底物存在下被“激活”，并且在易于代谢的碳源(例如，D-葡萄糖)存在下被“抑制”，经由称为“碳分解代谢物抑制”(下文称为“CCR”)的机制所述易于代谢的碳源优于植物生物质。因此，纤维素酶基因被葡萄糖紧紧抑制并被纤维素和某些二糖(例如槐糖、乳糖、龙胆二糖)诱导数千倍。例如，与含有葡萄糖的培养基相比，在含有诱导碳源(如纤维素或槐糖)的培养基上主要纤维二糖水解酶1(cbh1)的表达水平上被上调数千倍(Ilmen等人,1997)。此外，向“诱导的”里氏木霉培养物中添加“抑制”碳源显示覆盖(override)(纤维素或槐糖)诱导，从而导致纤维素酶基因表达的下调(el-Gogary等人,1989；Ilmen等人,1997)。因此，包含纤维素酶系统(酶)的基因的表达至少在转录水平上协调和调节，其中此系统的基因成员协同作用，并且如上所述是纤维素有效水解成可溶性寡糖所必需的。更具体地，全基因组分析显示在里氏木霉中存在至少十(10)个纤维素分解酶和十六(16)个木聚糖分解酶编码基因(Martinez等人,2008)。特别地，分泌的最丰富的酶是两种主要的纤维二糖水解酶(EC.3.2.1.91)、cbh1(纤维二糖水解酶1)和cbh2(纤维二糖水解酶2)，以及两种主要的特异性内切-β-1,4-木聚糖酶(EC3.3.1.8)、xyn1(内切-1,4-β-木聚糖酶xyn1)和xyn2(内切-1,4-β-木聚糖酶2)，在本文中称为“主要的工业相关的半纤维素酶和纤维素酶”或“MIHC”。这些MIHC与另外的酶一起起作用以降解纤维素和木聚糖，这导致可溶性寡糖和单糖(如纤维二糖、D-葡萄糖、木二糖和D-木糖)的形成。此外，槐糖是这些酶中某些酶的转糖基活性的产物(Vaheri等人,1979)。更特别地，文献中已经报道了这些可溶性寡糖和单糖(即，纤维二糖、D-葡萄糖、木二糖、D-木糖和槐糖)影响里氏木霉中MICH的表达。例如，D-葡萄糖的存在引起CCR，该CCR导致少量MIHC的分泌。据信，槐糖是cbh1和cbh2表达最有效的诱导物。D-木糖以浓度依赖性方式调节xyn1和xyn2表达。通常，常常通过固体培养或浸没培养(包括分批、补料分批、和连续流动过程)进行丝状真菌(如木霉属)对酶/多肽的商业规模生产。例如，木霉属中工业纤维素酶生产中最成问题和最昂贵的方面之一是向木霉属宿主细胞提供合适的诱导物(即，诱导底物)。例如，与实验室规模实验的情况一样，商业规模上的纤维素酶(酶)生产通过在固体纤维素(即，诱导底物)上使真菌细胞生长或通过在二糖诱导物(如“乳糖”(即，诱导底物))存在下培养细胞来“诱导”。不幸的是，在工业规模上，两种“诱导”方法都具有缺点，这导致与纤维素酶生产相关的高成本。例如，如上所述，纤维素酶合成受制于纤维素诱导和葡萄糖抑制。因此，影响在诱导型启动子控制下纤维素酶产量的关键因素是维持纤维素底物与葡萄糖浓度之间的适当平衡(即，获得调控基因产物的合理的商业产量是至关重要的)。尽管纤维素是有效且廉价的诱导物，但是当丝状真菌细胞生长在固体纤维素上时，控制葡萄糖浓度可能是有问题的。在低浓度的纤维素下，葡萄糖产生可能太慢以至于不能满足活性细胞生长和功能的代谢需要。在另一方面，当葡萄糖生成快于其消耗时，葡萄糖抑制可以停止纤维素酶合成。因此，需要昂贵的工艺控制方案来提供缓慢的底物添加和葡萄糖浓度的监测(Ju和Afolabi,1999)。此外，由于纤维素材料的固体性质，底物的缓慢连续递送可能难以实现。通过使用可溶性“诱导底物”(如“乳糖”、“槐糖”或“龙胆二糖”)可以克服与使用纤维素作为“诱导底物”相关的一些问题。例如，当使用乳糖作为“诱导底物”时，乳糖必须以高浓度提供，以便起诱导物和碳源的作用(例如，参见Seiboth等人,2002)。槐糖是比纤维素更有效的诱导物，但是槐糖价格昂贵且难以制造。例如，葡萄糖、槐糖和其他二糖的混合物(即，通过葡萄糖的酶促转化产生)可以用于纤维素酶的有效生产，这导致比单独使用葡萄糖更高的(生产)成本。因此，虽然它比固体纤维素更容易处理和控制，但是使用槐糖作为诱导底物仍然使得生产纤维素酶的成本极其昂贵。基于前述内容，显然本领域对于以下仍然存在持续且未满足的需求：通过丝状真菌而不需要或不要求提供昂贵的诱导底物(例如，槐糖、乳糖等)进行酶/多肽的成本有效的商业规模的生产。更特别地，本领域仍然存在通过丝状真菌宿主细胞商业规模生产一种或多种内源木质纤维素降解酶的需要，其中此类丝状真菌细胞能够在没有诱导底物的情况下表达这些基因中的一种或多种。此外，本领域对于以下还存在未满足的需求：成本有效地生产在此类丝状真菌宿主细胞中表达和产生的一种或多种异源蛋白产物，其中将编码此类蛋白的异源基因引入真菌宿主细胞中，该宿主细胞具有在不存在诱导底物的情况下表达这些异源基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种衍生自亲本丝状真菌细胞的变体丝状真菌细胞，所述变体细胞包含编码Ace3蛋白的引入的多核苷酸构建体，所述Ace3蛋白包含与SEQ ID NO:6的Ace3蛋白约90％序列同一性，其中相对于所述亲本细胞，所述变体细胞在不存在诱导底物的情况下产生增加量的目的蛋白(POI)，其中所述变体和亲本细胞在相似条件下培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.04 US 62/403,7871.一种衍生自亲本丝状真菌细胞的变体丝状真菌细胞，所述变体细胞包含编码Ace3蛋白的引入的多核苷酸构建体，所述Ace3蛋白包含与SEQIDNO:6的Ace3蛋白约90％序列同一性，其中相对于所述亲本细胞，所述变体细胞在不存在诱导底物的情况下产生增加量的目的蛋白(POI)，其中所述变体和亲本细胞在相似条件下培养。2.如权利要求1所述的变体细胞，其中相对于所述亲本细胞，所述变体细胞在存在诱导底物的情况下产生增加量的目的蛋白(POI)，其中所述变体和亲本细胞在相似条件下培养。3.如权利要求1所述的变体细胞，其中所述POI是内源POI或异源POI。4.如权利要求1所述的变体细胞，其中所述变体细胞包含编码异源POI的引入的多核苷酸构建体。5.如权利要求3所述的变体细胞，其中所述内源POI是木质纤维素降解酶。6.如权利要求5所述的变体细胞，其中所述木质纤维素降解酶选自由纤维素酶、半纤维素酶、或其组合组成的组。7.如权利要求5所述的变体细胞，其中所述木质纤维素降解酶选自由cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、egl6、bgl1、bgl2、xyn1、xyn2、xyn3、bxl1、abf1、abf2、abf3、axe1、axe2、axe3、man1、agl1、agl2、agl3、glr1、swo1、cip1和cip2组成的组。8.如权利要求3所述的变体细胞，其中所述异源POI选自由以下组成的组：α-淀粉酶、碱性α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚皮苷酶、果胶酶、支链淀粉酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、皱胃酶、高血压蛋白原酶、凝乳酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、酯酶、磷脂酶、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亚氨基酰化酶、谷氨酰胺酶、溶菌酶、青霉素酰化酶；异构酶、氧化还原酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羟基类固醇脱氢酶、过氧化物酶、裂解酶、天冬氨酸β-脱羧酶、富马酸酶、组氨酸酶、转移酶、连接酶、氨肽酶、羧肽酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、多酚氧化酶、核糖核酸酶和转谷氨酰胺酶。9.如权利要求1所述的变体细胞，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组中。10.如权利要求9所述的变体细胞，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组的端粒位点中。11.如权利要求9所述的变体细胞，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组的葡糖淀粉酶(gla1)基因座中。12.如权利要求1所述的变体细胞，其中所述多核苷酸构建体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQIDNO:4、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13约90％序列同一性。13.如权利要求1所述的变体细胞，其中所述编码的Ace3蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:12或SEQIDNO:1495％序列同一性。14.一种编码Ace3蛋白的多核苷酸ORF，所述Ace3蛋白包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:12或SEQIDNO:14约90％序列同一性。15.一种由如权利要求1所述的变体细胞产生的木质纤维素降解酶。16.一种由如权利要求1所述的变体细胞产生的异源POI。17.一种在不存在诱导底物的情况下用于在木霉属物种(Trichodermasp.)真菌细胞中产生目的内源蛋白的方法，所述方法包括：(i)向所述真菌细胞中引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体在5'至3'方向包含：(a)包含启动子的第一核酸序列和(b)有效地连接到所述第一核酸序列的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列编码包含与SEQIDNO:6约90％序列同一性的Ace3蛋白并包含“Lys-Ala-Ser-Asp”作为最后四个C-末端氨基酸，以及(ii)在适合于真菌细胞生长和蛋白产生的条件下发酵步骤(i)的细胞，其中此类适合的生长条件不包括诱导底物。18.如权利要求17所述的方法，其中所述多核苷酸构建体进一步包含在所述第二核酸3′端的并有效地连接到所述第二核酸的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列包含天然ace3终止子序列。19.如权利要求17所述的方法，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组中。20.如权利要求17所述的方法，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组的端粒位点中。21.如权利要求17所述的方法，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组的葡糖淀粉酶(gla1)基因座中。22.如权利要求17所述的方法细胞，其中所述多核苷酸构建体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQIDNO:4、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13约90％序列同一性。23.如权利要求17所述的方法，其中所述编码的Ace3蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:12或SEQIDNO:1495％序列同一性。24.如权利要求17所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：rev3启动子(SEQIDNO:15)、bxl启动子(SEQIDNO:16)、tkl1启动子(SEQIDNO:17)、PID104295启动子(SEQIDNO:18)、dld1启动子(SEQIDNO:19)、xyn4启动子(SEQIDNO:20)、PID72526启动子(SEQIDNO:21)、axe1启动子(SEQIDNO:22)、hxk1启动子(SEQIDNO:23)、dic1启动子(SEQIDNO:24)、opt启动子(SEQIDNO:25)、gut1启动子(SEQIDNO:26)、和pki1启动子(SEQIDNO:27)。25.一种在不存在诱导底物的情况下用于在木霉属物种真菌细胞中产生目的内源蛋白的方法，所述方法包括：(i)向所述真菌细胞中引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体在5'至3'方向包含：(a)包含启动子的第一核酸序列和(b)有效地连接到所述第一核酸序列的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列编码包含与SEQIDNO:12约90％序列同一性的Ace3蛋白，以及(ii)在适合于真菌细胞生长和蛋白产生的条件下发酵步骤(i)的细胞，其中此类适合的生长条件不包括诱导底物。26.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含在所述第二核酸3′端的并有效地连接到所述第二核酸的第三核酸序列，其中所述第三核酸序列包含天然ace3终止子序列。27.如权利要求25所述的方法，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组中。28.如权利要求25所述的方法，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组的端粒位点中。29.如权利要求25所述的方法，其中将所述多核苷酸构建体整合到所述真菌细胞基因组的葡糖淀粉酶(gla1)基因座中。30.如权利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQIDNO:4、SEQIDNO:11或SEQIDNO:13约90％序列同一性。31.如权利要求25所述的方法，其中所述编码的Ace3蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQIDNO:6、SEQIDNO:12或SEQIDNO:1495％序列同一性。32.如权利要求25所述的方法，其中所述启动子选自由以下组成的组：rev3启动子(SEQIDNO:15)、bxl启动子(SEQIDNO:16)、tkl1启动子(SEQIDNO:17)、PID104295启动子(SEQIDNO:18)、dld1启动子(SEQIDNO:19)、xyn4启动子(SEQIDNO:20)、PID72526启动子(SEQIDNO:21)、axe1启动子(SEQIDNO:22)、hxk1启动子(SEQIDNO:23)、dic1启动子(SEQIDNO:24)、opt启动子(SEQIDNO:25)、gut1启动子(SEQIDNO:26)、和pki1启动子(SEQIDNO:27)。33.一种在不存在诱导底物的情况下用于在木霉属物种真菌细胞中产生目的异源蛋白的方法，所述方法包括：(i)向所述真菌细胞中引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体在5'至3'方向包含：(a)包含组成型启动子的第一核酸序列和(b)有效地连接到所述第一核酸序列的第二核酸序列，其中所述第二核酸序列编码包含与SEQIDNO:6约90％序列同一性的Ace3蛋白并包含“Lys-Ala-Ser-Asp”作为最后四个C-末端氨基酸，以及(ii)在适合于真菌细胞生长和蛋白产生的条件下发酵步骤(i)的细胞，其中此类适合的生长条件不包括诱导底物。34.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·华德，Y·罗，F·O·本德苏，M·瓦尔科宁，M·萨罗海摩，N·阿罗，T·帕库拉，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，芬兰VTT技术研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US