本发明专利技术公开了一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法，属于真菌毒素防控技术领域。所述方法包括：(1)构建Tri1‑GFP::ΔTri1菌株；(2)将Tri1‑GFP::ΔTri1菌株接种于TBI培养基，培养，加入待筛选的化合物，继续培养，然后观察绿色荧光蛋白在菌体内的积累情况，与未添加待筛选化合物的对照相比，根据荧光强度强弱来判断该化合物对赤霉病菌合成DON的抑制效果。本发明专利技术利用病菌中DON合成量与DON合成关键限速酶Tri1蛋白量呈显著的正相关的特点，选择测定Tri1蛋白量用于指示DON毒素的合成量，可快速的检测待测定化合物对赤霉病菌DON产毒的抑制效果，大大节约测定成本。
A Rapid Method for Screening Compounds Inhibiting DON Toxin Synthesis of Scab Fungus
The invention discloses a method for rapidly screening compounds that inhibit DON toxin synthesis of scab fungi, belonging to the technical field of mycotoxin prevention and control. The methods include: (1) constructing Tri1 GFP::Tri1 strain; (2) inoculating Tri1 GFP:Tri1 strain into TBI medium, culturing, adding compounds to be screened, and continuing culture, then observing the accumulation of green fluorescent protein in the bacteria, and judging the inhibition of the compound on DON synthesis by Scab fungus according to the intensity of fluorescence compared with the control without adding compounds to be screened. System effect. The invention utilizes the remarkable positive correlation between the DON synthesis amount in pathogens and the protein amount of Tri1, the key rate-limiting enzyme for DON synthesis, and chooses the determination of Tri1 protein amount to indicate the synthesis amount of DON toxin, which can quickly detect the inhibitory effect of the compounds to be determined on DON production of Fusarium head blight, and greatly saves the cost of determination.
【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法
本专利技术涉及真菌毒素防控
，尤其涉及一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法。
技术介绍
小麦是我国重要的粮食作物，种植面积约占我国粮食种植总面积的25％。随着气候变化和耕作制度的改变，由禾谷镰刀菌复合种(Fusariumgraminearumcomplex)引起的小麦赤霉病已经成为小麦上重要的真菌病害，严重影响小麦产量。此外，赤霉病菌在侵染小麦上产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，又称呕吐毒素)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)等多种真菌毒素，其中，DON对人畜具有很强的毒性，人畜误食DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐等急性中毒症状，严重时损害免疫系统造成死亡。DON毒素已经被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为“最危险的自然发生食品污染物”之一。世界上大多数国家对食品中DON毒素含量都有了明确的限量标准。我国粮食中DON毒素的限量标准是1mg/kg。近几年，由于赤霉病流行成灾，我国多地小麦样品中DON的含量出现超标问题，解决镰刀菌毒素污染已经成为保障食品安全的重要任务。为防治病害，越来越多的杀菌剂被投入使用，例如：多菌灵、甲基硫菌灵、戊唑醇、氰烯菌酯、叶菌唑等，又如申请公布号为CN104068025A的专利文献公开了一种杀菌组合物，其活性成分为氰烯菌酯和丙硫菌唑，该药物组合物具有增效作用，能够显著抑制赤霉病菌毒素的形成。但是大量杀菌剂长时间使用容易导致病菌产生抗药性，此外，杀菌剂使用不当导致真菌抗逆性被激活，促进毒素相关基因表达，导致毒素生成量大幅度提高，而且为食品安全埋下隐患。因此，研发和应用有效的防治病害又抑制毒素的药剂是防治赤霉病菌的主要措施之一。目前评价杀菌剂抑制病菌DON毒素形成的效果主要依靠液相色谱-串联质谱法(LCMS/MS)和酶联免疫吸附(ELISA)方法来测定，LCMS/MS定量检测DON需等待病菌产生毒素后才能进行DON测定，费时并且DON毒素提取过程比较繁琐；DON的检测费用比较昂贵，目前市场上一个样品检测费用约1500元，不利于大批量筛选抑制DON形成的化合物。因此，研发高效、便宜的DON毒素测定方法有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以快速筛选能够抑制赤霉病菌合成DON的化合物的方法，节约测定成本、缩短测定时间，可以用于抑制呕吐毒素合成化合物的大量筛选工作。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：Tri1(CytochromeP450monooxygenase,DON合成倒数第二步的催化酶)蛋白作为标志物在制备检测赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒中的应用。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，又称呕吐毒素)属于单端孢霉烯族类毒素，由乙酰CoA经过一系列酶催化反应形成。目前已经明确16个TRI(Trichothecenebiosynthesis)基因编码的蛋白参与DON毒素的生物合成，Tri4(DON合成的第二步催化酶)和Tri1作为合成DON合成的关键酶，在毒素合成诱导条件(TBI)下，Tri1和Tri4会聚集在“产毒体”上。本专利技术研究表明，Tri1蛋白量和DON的合成呈正相关，因此，通过观察Tri1在毒素体的积累情况，可以判断DON的合成量。所述的Tri1蛋白包括512个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了Tri1蛋白作为标志物在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化合物中的应用。本专利技术选择编码Tri1蛋白的基因(NCBI登录号为：XM_011317365.1)作为靶基因构建了菌株Tri1-GFP::ΔTri1，即将GFP(绿色荧光蛋白)标记的Tri1融合基因转入Tri1基因敲除突变体(ΔTri1)中，进而通过观察荧光蛋白GFP在毒素体上的积累量，确定该菌株毒素合成量；在此基础上，利用该菌株(Tri1-GFP::ΔTri1)筛选抑制或刺激DON合成的化合物。因此，本专利技术提供了Tri1-GFP::ΔTri1菌株在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成DON的化合物中的应用，所述Tri1-GFP::ΔTri1菌株的构建方法，包括：以禾谷镰刀菌作为亲本菌株，利用同源重组技术将基因组中的Tri1基因替换成Tri1-GFP融合基因，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株。本专利技术还提供了一种快速筛选抑制赤霉病菌合成DON的化合物的方法，包括以下步骤：(1)构建Tri1-GFP::ΔTri1菌株：以禾谷镰刀菌测序菌株PH-1作为亲本菌株，利用同源重组技术敲除Tri1基因，获得突变体ΔTri1；再利用PCR和原生质转化技术将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的Tri1-GFP融合基因转入ΔTri1突变体的基因组中，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株；(2)将Tri1-GFP::ΔTri1菌株接种于TBI培养基，培养24-30h后，加入待筛选的化合物，继续培养24-36h，然后观察绿色荧光蛋白在菌体内的积累情况，与未添加待筛选化合物的对照相比，根据荧光强度强弱来判断该化合物对赤霉病菌合成DON的抑制效果。将新鲜的Tri1-GFP::ΔTri1菌丝接种于含TBI(呕吐毒素合成诱导培养基)的三角瓶中，摇床上震荡培养，培养24-30小时后向三角瓶中加入待筛选的化合物，再继续培养24-36h，然后利用激光共聚焦显微镜观察Tri1-GFP在菌体内的积累情况，根据荧光强度强弱来判断化合物对毒素的抑制效果：Tri1-GFP荧光强度越弱，表明待测定化合物抑制呕吐毒素的作用越强；相反，Tri1-GFP荧光强度越强，表明待测定化合物抑制呕吐毒素的效果越差。作为优选，步骤(2)中，培养的条件为：培养温度为28℃、转速为150-180rpm。作为优选，通过ImageJ软件进行荧光强度定量。本专利技术具备的有益效果：本专利技术利用病菌中DON合成量与DON合成关键限速酶Tri1蛋白量呈显著的正相关的特点，选择测定Tri1蛋白量用于指示DON毒素的合成量。本专利技术构建了Tri1-GFP::ΔTri1菌株，通过Tri1-GFP的荧光蛋白量可以准确判断菌体DON毒素合成量，并以此菌株为实验对象，可快速的检测待测定化合物对赤霉病菌DON产毒的抑制效果，每个样品测定成本仅需5元左右，大大节约测定成本、缩短测定时间，可以用于抑制呕吐毒素合成化合物的大量筛选工作。附图说明图1为氰烯菌酯对赤霉病菌DON合成的抑制效果，(A)Tri1-GFP::ΔTri1菌株在TBI中预培养24h后，加入1.0mg/L多菌灵或0.3mg/L的氰烯菌酯，这两种药剂分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，以DMSO作为溶剂对照，药剂处理24h后，荧光显微镜下观察Tri1-GFP的荧光量，Bar＝10μm；(B)利用ImageJ软件定量测定的荧光强度，并通过LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)；(C)将各处理样品培养7天后，利用LCMS/MS进行定量检测DON的含量，并利用LSD进行差异显著性分析(P＝0.05)。图2为氰烯菌酯和氟唑菌酰羟胺混剂对赤霉病菌DON的合成抑制效果，(A)Tri1-GFP::ΔTri1菌株在TBI中预培养24h后，加入氰烯菌酯和氟唑菌酰羟胺混剂(氰烯菌酯浓度为0.15mg/L，氟唑菌酰羟胺的浓度为0.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Tri1蛋白作为标志物在制备检测赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.Tri1蛋白作为标志物在制备检测赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的试剂盒中的应用。2.Tri1蛋白作为标志物在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化合物中的应用。3.Tri1-GFP::ΔTri1菌株在筛选抑制或刺激赤霉病菌合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇的化合物中的应用，其特征在于，所述Tri1-GFP::ΔTri1菌株的构建方法，包括：以禾谷镰刀菌作为亲本菌株，利用同源重组技术将基因组中的Tri1基因替换成Tri1-GFP融合基因，获得Tri1-GFP::ΔTri1菌株。4.一种快速筛选抑制赤霉病菌DON毒素合成的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建Tri1-GFP::ΔTri1菌株：以禾谷镰刀菌测序菌株PH-1作为亲本菌株，利用同...
【专利技术属性】
技术研发人员：马忠华，唐广飞，陈云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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