一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。该基因工程菌的基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。该基因工程菌的构建过程无需对菌株进行单核处理，从而避免了通过同源重组发生单交换、遗传稳定性差以及易发生回复突变等问题；该基因工程菌不产生杂色曲霉素，且棘白菌素B产量较野生菌株可提高44％，并且经过多次传代，发酵性状仍维持稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
棘白菌素B(EchinocandinB，ECB)作为天然环脂肽类化合物，具有较强的抗真菌作用。在其基础上进行侧链修饰后获得的阿尼芬净在2006年被FDA批准用于真菌感染的治疗，具有低毒、高安全性、广谱的优势，市场前景良好。棘白菌素B可以通过德拉克洛瓦曲霉(Aspergillusdelacroxii)NRRL3860(＝Asp.nidulansvar.echinulatus，此为以前文献中标识的菌种名)(BenzF,KnüselF,NüeschJ,TreichlerH,VoserW,NyfelerR,Keller-Schierlein,W.StoffwechselproduktevonMikroorganismen143.Mitteilung.EchinocandinB,einneuartigesPolypeptid-AntibioticumausAspergillusnidulansvar.echinulatus:IsolierungundBausteine.HelvChimActa.1974；57(8):2459–77；CIBAGEIGYAG.AntifungalantibioticA32204productionbyaerobiccultivationofAspergillusnidulansvar.echinulatusA32204.Swisspatent568386.1975；SamsonRA,VisagieCM,HoubrakenJ,HongSB,HubkaV,KlaassenCHW,PerroneG,SeifertKA,SuscaA,TanneyJB,etal.Phylogeny,identificationandnomenclatureofthegenusAspergillus.StudMycol.2014；78:141–73.)、厚冠突曲霉(Aspergilluspachycristatus)NRRL11440(＝Asp.nidulansvar.roseusNRRL11440)、皱褶曲霉(Aspergillusrugulosus)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)NRRL8112(＝EmericellanidulansDSM946)等菌株发酵产生，但是这些Aspergillussp.会产生大量杂色曲霉素。杂色曲霉素与黄曲霉素结构类似，具有相似的生物毒性，其主要污染玉米、花生、大米和小麦等谷物，尽管污染范围和程度不如黄曲霉毒素，然而在肝癌和食管癌高发地区居民所使用的食物中，杂色曲霉素污染较为严重。且由于杂色曲霉素具有极强的致癌毒性，在实际生产操作中对人体健康也极为不利。Hodges(R.L.Hodges,D.W.Hodges,K.Goggans，etal.GeneticmodificationofanechinocandinB-producingstrainofAspergillusnidulanstoproducemutantsblockedinsterigmatocystinbiosynthesis.JournalofIndustrialMicrobiology,13(1994)372-381)等人对多核高产菌株C747进行传统诱变及大批量筛选，均未获得去除杂色曲霉素的高产菌株，随后通过对菌株C747进行单核处理获得单核菌株C747-GR14，在菌株C747-GR14的基础上进行传统诱变获得降低杂色曲霉素含量的突变菌株OC-1和OC-2，但是突变菌株均未提高棘白菌素B的产量，且产量明显低于原始菌株C747，并且低于出发菌株C747-GR14，不适合工业生产。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有的产棘白菌素B的方法中存在的发酵过程中产生大量强致癌物质——杂色曲霉素以及在现有改造过程中棘白菌素B产量不高的缺陷，提供一种去除了杂色曲霉素且还能提高产物菌素产量的产棘白菌素B的基因工程菌及其构建方法和应用。本申请人为获得不产杂色曲霉素同时高产棘白菌素B的基因工程菌株，在理论的基础上进行了大量的尝试。当通过现有技术中常用的同源重组发生单交换，导致目的菌株的遗传稳定性差、极易发生回复突变；且所得菌株的产棘白菌素B的水平往往相比于未改造菌株有所下降，不利于工业化生产。或者如上所述的传统诱变也存在虽然去除了杂色曲霉素但是棘白菌素B产量大幅下降的问题。可见，现有的改造棘白菌素B产生菌以降低杂色曲霉素产量，同时保证棘白菌素B的生产水平的方法并不成熟。而本专利技术意外发现将产棘白菌素B的同时也产杂色曲霉素的菌株中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因进行失活或者敲除后，该菌株不但不产杂色曲霉素，而且其产棘白菌素B的能力与改造前的菌株相比，不仅没有下降，甚至具有大幅度的提高。本专利技术解决上述技术问题的技术方案具体如下：本专利技术提供一种产棘白菌素B的基因工程菌，其基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。其中，所述失活指的是本领域常规意义上的基因失活，通常可以利用反义技术使目的基因或者有害基因不表达或者降低其表达活性。所述的基因修饰可为本领域常规，较佳地为基因中碱基的增添、替换或者缺失，只要能使杂色曲霉素不表达即可。理论上，只要是在上述基因外显子部分所述缺失的碱基个数至少为1bp即可实现；若含有内含子的情况下，所述缺失的碱基个数至少为100bp。所述的基因工程菌所用菌种可为本领域常规的产棘白菌素B的菌种，例如德拉克洛瓦曲霉(Aspergillusdelacroxii)、厚冠突曲霉(Aspergilluspachycristatus)、皱褶曲霉(Aspergillusrugulosus)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)，所用的菌株较佳地为德拉克洛瓦曲霉(Aspergillusdelacroxii)NRRL3860、厚冠突曲霉(Aspergilluspachycristatus)NRRL11440或者构巢曲霉(Aspergillusnidulans)NRRL8112。在本专利技术一较佳实施例中，所用菌株为德拉克洛瓦曲霉(Aspergillusdelacroxii)NRRL3860。较佳地，所述缺失的碱基的核苷酸序列具有如序列表中SEQIDNO.1所示的序列。本专利技术还提供一种生产棘白菌素B的方法，所述方法包括如下步骤：(1)培养上述的基因工程菌以产生含有棘白菌素B的发酵产物；(2)从步骤(1)所得发酵产物中分离出棘白菌素B。本专利技术还提供一种上述基因工程菌的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：(1)构建敲除质粒，所述敲除质粒依次含有以下元件：杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因的左、右同源臂序列；所述敲除质粒缺失杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因；(2)将步骤(1)所得敲除质粒转化至农杆菌(Agrobacterium)中；(3)将步骤(2)所得农杆菌的菌液与产棘白菌素B以及杂色曲霉素的菌株的孢子液混合；筛选所述左、右同源臂序列与所述菌株的基因组发生同源重组的菌株。其中，步骤(1)中所述敲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于，其基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。

【技术特征摘要】
1.一种产棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于，其基因组中的杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因被失活或者对该基因进行基因修饰以使其不表达杂色曲霉素。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因修饰为基因中碱基的增添、替换或者缺失，所述缺失的碱基个数至少为1bp；较佳地，所述缺失的碱基个数至少为100bp。3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为德拉克洛瓦曲霉(Aspergillusdelacroxii)NRRL3860；较佳地，所述缺失的碱基的核苷酸序列具有序列表中SEQIDNO.1所示的序列。4.一种生产棘白菌素B的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)培养如权利要求1～3任一项所述的基因工程菌以产生含有棘白菌素B的发酵产物；(2)从步骤(1)所得发酵产物中分离出棘白菌素B。5.一种如权利要求1～3任一项所述产棘白菌素B的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：(1)构建敲除质粒，所述敲除质粒依次含有以下元件：杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因的左、右同源臂序列；所述敲除质粒缺失杂色曲霉素合成相关的聚酮合酶基因；(2)将步骤(1)所得敲除质粒转化至农杆菌(Agrobacterium)中；(3)将步骤(2)所得农杆菌的菌液与产棘白菌素B以及杂色曲霉素的菌株的孢子液混合；筛选所述左、右同源臂序列与所述菌株的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡海峰，闵涛玲，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海,31