去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法技术

本发明专利技术公开了去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法。本发明专利技术公开的去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法，采用CRISPR/Cas9系统完成，CRISPR/Cas9系统中包含名称为sgRNA1的sgRNA，sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列，靶序列为序列表中序列3的第1‑20位所示的DNA片段。本发明专利技术采用CRISPR/Cas9系统进行炭疽芽胞杆菌毒力大质粒pXO1质粒的去除，成功得到了不含有pXO1质粒的炭疽芽胞杆菌，本发明专利技术的方法操作简单，为构建新的疫苗株提供了更快捷、更方便新的手段，为炭疽芽胞杆菌的防治提供了新的思路。

Removal of pXO1 Plasmid from Bacillus anthracis

The invention discloses a method for removing pXO1 plasmid from Bacillus anthracis. The method for removing pXO1 plasmid from Bacillus anthracis disclosed in the present invention is accomplished by CRISPR/Cas9 system. The CRISPR/Cas9 system contains sgRNA named sgRNA1. The target sequence recognized by sgRNA1 is a specific sequence contained by pXO1 plasmid but not by Bacillus anthracis. The target sequence is the DNA fragment shown at position 1 to 20 of sequence 3 in the sequence table. The invention adopts CRISPR/Cas9 system to remove the virulent large plasmid pXO1 of Bacillus anthracis, and successfully obtains Bacillus anthracis without pXO1 plasmid. The method of the invention is simple in operation, provides a faster, more convenient and new means for constructing a new vaccine strain, and provides a new idea for the prevention and control of Bacillus anthracis.

【技术实现步骤摘要】
去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法
本专利技术涉及生物
中，去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法。
技术介绍
炭疽芽胞杆菌(也称为炭疽芽胞杆菌)是一种革兰氏阳性、能形成芽胞的需氧杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高,造成极大经济损失，威胁生命安全。炭疽杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。质粒pXO1编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及它们的调控蛋白。质粒pXO2编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽杆菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建去除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽杆菌致病中的作用及与染色体的相关调控非常重要。早期去除细菌的大质粒可以使用化学试剂，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高温培养或紫外照射等方法。但是这些方法都有潜在的问题，第一是特异性差，即在去除目的质粒的过程中可能去除目的质粒以外的其他质粒，第二是可能在处理过程中宿主细胞产生随机突变的可能性。CRISPR/Cas系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，被认为是原核生物防御外来噬茵体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统，该系统中的crRNA在一个反式激活crRNA(tracrRNA)的辅助下，募集效应蛋白(Cas蛋白)并把它们带到靶标DNA序列，Cas蛋白利用其核酸酶的功能切割外源DNA序列，引起DNA双链断裂(DoubleStrandBreak,DSB)。目前该系统已经被广泛利用进行基因编辑。为了更方便简单的利用该系统，研究人员将II型CRISPR/Cas9系统中的crRNA-tracrRNA双链RNA复合体人工改造为一条嵌合的单链RNA，被称为单向导RNA(singleguideRNA，sgRNA)，依靠其5’端20nt(即为spacer序列，这里称为N20)的特异性的序列配对来靶向DNA位点，靶DNA序列3’末端的PAM(5’-NGG-3’)为Cas9识别位点，不能包含在sgRNA之中。应用的时候只需更换sgRNA的5’末端的N20序列就能够指导Cas蛋白切割不同的目标DNA序列。2013年该系统率先应用到人类和小鼠胚胎干细胞的基因编辑中，目前已经成功应用到小鼠、猪、食蟹猴、斑马鱼、拟南芥、高粱、烟草、水稻、线虫、酵母、大肠杆菌等多种动植物和微生物中，成为生物学和医学各领域广泛应用的基因编辑工具。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何去除炭疽芽胞杆菌pXO1质粒。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统去除出发炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒，所述CRISPR/Cas9系统中包含名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列。所述出发炭疽芽胞杆菌含有pXO1质粒。所述出发炭疽芽胞杆菌可含有pXO1质粒，不含有pXO2质粒。在本专利技术的一个实施例中，所述出发炭疽芽胞杆菌为A16PI2。上述方法中，所述靶序列可为如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列3的第1-20位所示的DNA片段；A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA片段；A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA片段。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的序列3的第1-20位具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述方法中，所述sgRNA1的序列具体可为将序列表中序列3中的T替换为U得到的RNA序列。上述方法可包括向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒，使所述sgRNA1得到表达，得到去除pXO1质粒的炭疽芽胞杆菌。向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒可通过将含有所述表达盒的重组载体导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统还可包括Cas9蛋白质。Cas9蛋白质的序列可为序列表中序列2。上述方法还可包括将含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒导入所述出发炭疽芽胞杆菌中，使Cas9蛋白质得到表达。所述Cas9蛋白质的编码基因可为序列表中序列1所示的DNA分子。上述方法中，所述将含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒导入所述出发炭疽芽胞杆菌中可通过将含有所述表达盒的重组载体导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。具体的，含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒和含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒可通过含有这两个表达盒的重组载体导入所述出发炭疽芽胞杆菌中实现。所述重组载体具体可为pJO1T，所述pJO1T为向出发载体的多克隆位点间插入所述靶序列得到的能表达所述sgRNA1和Cas9蛋白质的重组载体。所述出发载体可为温敏型载体，如pJOE8999。所述方法还可包括在向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入所述重组载体前对所述重组载体进行去甲基化。所述去甲基化可通过将所述重组载体导入大肠杆菌SCS110中实现。所述方法还可包括在去除pXO1质粒后再去除所述重组载体。所述去除所述重组载体可将导入所述重组载体且已去除pXO1质粒后的重组炭疽芽胞杆菌在所述重组载体敏感的温度下进行培养，获得所述重组载体和pXO1质粒均去除的目的炭疽芽胞杆菌。所述重组载体敏感的温度可为37-42℃。本专利技术还提供了一种sgRNA，所述sgRNA为所述sgRNA1；本专利技术还提供了与所述sgRNA1相关的生物材料(记为生物材料1)，所述生物材料1为下述B1)至B4)中的任一种：B1)编码所述sgRNA1的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。B1)所述核酸分子可为序列表中序列3所示的DNA分子。B2)所述的含有编码所述sgRNA1的核酸分子的表达盒(sgRNA1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达sgRNA1的DNA，该DNA不但可包括启动sgRNA1基因转录的启动子，还可包括终止sgRNA1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述sgRNA1基因表达盒的重组载体。所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pJOE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统去除出发炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒，所述CRISPR/Cas9系统中包含名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列。

【技术特征摘要】
1.去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9系统去除出发炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒，所述CRISPR/Cas9系统中包含名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA1识别的靶序列为pXO1质粒含有而炭疽芽胞杆菌不含有的特异序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶序列为如下A1)、A2)或A3)：A1)序列表中序列3的第1-20位所示的DNA片段；A2)与A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA片段；A3)在严格条件下与A1)限定的DNA序列杂交的由A1)衍生的DNA片段。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA1的序列为将序列表中序列3中的T替换为U得到的RNA序列。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述出发炭疽芽胞杆菌中导入含有所述sgRNA1的编码基因的表达盒，使所述sgRNA1得到表达，得到去除pXO1质粒的炭疽芽胞杆菌。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统还包括Cas9蛋白质。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将含有Cas9蛋白质的编码基因的表达盒导入所述出发炭疽芽胞杆菌中，使Cas9蛋白质得到表达。7.sgRNA，为权利要求1-3中任一所述sgRNA1。8.与权利要求1-3中任一所述sgR...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘先凯，王东澍，冯尔玲，王晓景，吕宇飞，潘超，朱力，王恒樑，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11