一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法技术方案

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法。本发明专利技术包括以下步骤：1)设计高效识别敲除后致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠；3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代，基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。本发明专利技术的技术方案与ES细胞基因打靶方式构建致死基因全身性敲除小鼠模型的现有技术相比，操作步骤简单，操作难度低，并且制作周期短，周期仅为4个月左右。

A method of constructing lethal gene knockout mice model by CRISPR/Cas9 system

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for constructing a lethal gene knockout mouse model using CRISPR/Cas9 system. The invention comprises the following steps: 1) designing a sgRNA sequence for efficiently identifying the PAM region of the knockout lethal gene; 2) mixing Cas9's mRNA or protein with the sgRNA designed in step 1, microinjecting the mixture into any blastomere cell of a mouse two-cell embryo, embryo transplantation after injection, strain gene identification, and obtaining chimerism-positive first-built mice with knockout lethal gene;3) positive chimerism; The first hybrid mice were bred with wild-type mice to produce F1 generation. After gene identification, the whole-body knockout of lethal gene was finally obtained, and the mouse model for generational breeding was constructed. Compared with the existing technology of constructing lethal gene knockout mice model by ES cell gene targeting, the technical scheme of the present invention has the advantages of simple operation steps, low operation difficulty, short production cycle and a period of only about 4 months.

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法。
技术介绍
全身性基因敲除小鼠模型是研究基因功能中较为普遍的一种方法，广泛运用到目的基因对全身生理或病理的功能研究中。其中，致死基因因为在机体内发挥重要作用从而受到特别关注。致死基因是指基因功能的缺失导致个体在胚胎期和出生后死亡的一类基因，包括胚胎期致死性基因和出生后致死基因。致死基因全身性敲除的小鼠模型必须通过杂合子的形式进行传代繁育。研究预测在小鼠基因中，致死基因约占23％(Cell,2013,154:452；Nature2016,537:508)。基于胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶或敲除的方法是构建致死基因全身性敲除小鼠模型的现有方法，大体包括以下4个步骤：(1)敲除载体设计与构建；(2)敲除ES细胞筛选；(3)敲除ES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠；(4)由嵌合体小鼠繁殖出生殖遗传系的致死性基因敲除小鼠。但是，此方法制作步骤繁琐，技术操作难度高，并且制作周期长，周期为1年以上(NatRevGenet,2005,6:507)。CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。使用CRISPR系统将Cas9mRNAs或蛋白和向导RNA显微注射到小鼠受精卵里，实现基因敲除，从而构建全身性基因敲除小鼠模型。与传统的ES细胞基因打靶方法相比，该方法的实验周期和材料成本大大缩短和降低，已广泛运用到非致死性基因全身性敲除的小鼠模型构建中(Cell,2013,153:910)。但是，由于CRISPR/Cas9系统基因敲除效率高，受精卵显微注射方式通常造成致死性基因全身性敲除的首建鼠(F0代)无法出生(胚胎期致死性基因)或性成熟前死亡(出生后致死性基因)。性成熟期后F0代鼠的缺乏限制致死性基因敲除的传代繁育(F1代)。因此，运用CRISPR/Cas9系统通过受精卵显微注射方式无法实现可传代繁育的致死基因全身性敲除小鼠模型的构建。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种可传代繁育的致死基因全身性敲除小鼠模型的制备方法，此方法适用于胚胎期致死性基因和出生后致死性基因。通过该方法可以简单、快速、高效地获得可传代繁育的致死基因全身性敲除小鼠。本专利技术的具体技术方案如下：本专利技术的利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠；3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代，基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。本专利技术所述的方法，可以针对任意种类的致死基因，包括但不限于Actr6，Armc7，Armh3，Arpc3，Atad3a，Atp5e，Atp5f1，Atxn10，Cenpl，Chka，Chmp6，Copg1，Cpsf3，Crls1，Ctla-4，Ctr9，Dars2，Dctn1，Dctn4，Ddx55，Dhodh，Dhps，Dhx33，Dpm1，Dync1i2，Dynlrb1，Ears2，Elac2，Exoc3，Exosc9，Fdft1，Fignl1，Gbf1，Gtf2h2，Ints11，Ints2，Kif18b，L3mbtl2，Lars，Leo1，Lsm10，Mau2，Med19，Mrps21，Mrps5，Mtor，Nat10，Ndufb8，Nelfe，Nhlrc2，Nhp2，Npat，Nup85，Ogdh，Orc1，Pam16，Pdcd2，Pgap2，Pitrm1，Pold3，Polr2f，Polr3f，Polr3g，Rbm33，Rnasek，Rpia，Sap130，Setd1a，Sfpq，Slc17a5，Slu7，Smc3，Smg1，Srsf7，Supt5，Taf11，Tet3，Timeless，Tmem30a，Trub2，Usp37，Usp5，Virma，Vps33b，Wac等中的一种或几种，进一步优选地，所述致死基因为Slc17a5和/或Virma。根据本专利技术所述的方法，作为优选地，所述致死基因为Slc17a5，sgRNA序列如SEQIDNO.1所示。或者，所述致死基因为Virma，sgRNA序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种致死基因全身性敲除小鼠模型，所述小鼠模型由上述任一的方法构建而成。本专利技术还提供了所述构建的小鼠模型在分析致死基因在机体内功能的科学研究及构建疾病模型用于药物筛选方面的应用。本专利技术还提供了一种构建致死基因全身性敲除小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒包括致死基因PAM区域的sgRNA序列和Cas9的mRNA或蛋白。所述试剂盒可以针对任意种类的致死基因，其中包括但不限于上述的致死基因。作为优选地，所述致死基因为Slc17a5(出生后致死基因)，sgRNA序列如SEQIDNO.1所示；或者，所述致死基因为Virma(胚胎期致死基因)，sgRNA序列如SEQIDNO.2所示；再或者，所述sgRNA序列为前述两种的组合。针对致死性基因全身性敲除小鼠模型，运用CRISPR/Cas9系统通过常规的受精卵显微注射的方式，不能得到致死性基因全身性敲除的首建鼠(F0代)，从而无法构建致死性基因全身性敲除的小鼠模型。本专利技术运用CRISPR/Cas9系统通过二细胞胚胎注射的方式成功构建致死性基因全身性敲除的首建鼠(包括胚胎致死性基因和出生后致死基因)，并将致死性突变传递给F1代，从而证明二细胞胚胎注射的方式构建致死性基因全身性敲除小鼠模型的创新性和可行性。基于胚胎干细胞(ES细胞)基因打靶或敲除的方法是构建致死基因全身性敲除小鼠模型的现阶段报道的唯一方法，此方法制作步骤繁琐，技术操作难度高，并且制作周期长，周期为1年以上。但是，本专利技术的二细胞胚胎注射的方法操作步骤简单，操作难度低，并且制作周期短，周期为4个月左右。本专利技术可以完全替代常规的胚胎干细胞基因打靶的方法构建致死基因全身性敲除小鼠模型，提高工作效率，降低生产成本。并且，此方法适用于各类品系小鼠致死基因全身性敲除模型的制备。本专利技术的技术方案与ES细胞基因打靶方式构建致死基因全身性敲除小鼠模型的现有技术相比，操作步骤简单，操作难度低，并且制作周期短，周期仅为4个月左右。附图说明图1为本专利技术实施例1中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果；图2为本专利技术实施例1中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段TA克隆结果；图3为本专利技术实施例1的F1代鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果；图4为本专利技术本专利技术实施例2中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果；图5为本专利技术实施例2的F1代鼠的的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠；3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代，基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性首建鼠；3)阳性首建鼠与野生型鼠配种产生F1代，基因鉴定确认后最终得到致死基因全身性敲除的杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致死基因为Actr6，Armc7，Armh3，Arpc3，Atad3a，Atp5e，Atp5f1，Atxn10，Cenpl，Chka，Chmp6，Copg1，Cpsf3，Crls1，Ctla-4，Ctr9，Dars2，Dctn1，Dctn4，Ddx55，Dhodh，Dhps，Dhx33，Dpm1，Dync1i2，Dynlrb1，Ears2，Elac2，Exoc3，Exosc9，Fdft1，Fignl1，Gbf1，Gtf2h2，Ints11，Ints2，Kif18b，L3mbtl2，Lars，Leo1，Lsm10，Mau2，Med19，Mrps21，Mrps5，Mtor，Nat10，Ndufb8，Nelfe，Nhlrc2，Nhp2，Npat，Nup85，Ogdh，Orc1，Pam16，Pdcd2，Pgap2，Pitrm1，Pold3，Polr2f，Polr3f，Polr3g，Rbm33，Rnasek，Rpia，Sap130，Setd1a，Sfpq，Slc17a5，Slu7，Smc3，Smg1，Srsf7，Supt5，Taf11，Tet3，Timeless，Tmem30a，Trub2，Usp37，Usp5，Virma，Vps33b，Wac等中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述致死基因为Slc17a5和/或Virma。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述致死基因为Slc17a5，sgRNA序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求3所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢静，仵毅，陈柏安，鲁飞翔，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11