一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，通过PCR扩增反应将含有启动子、基因编码区、poly A信号的基因表达核心组件序列拆分成2～3个线性双链DNA分子作为输入，转染入细胞中。在所有线性双链DNA分子同时出现时，通过细胞内的连接反应，这些线性双链DNA分子重新形成完整的基因表达核心组件序列并实现基因表达，由此实现与门逻辑运算。本发明专利技术提供了一种基于线性双链DNA分子的低噪信比与门逻辑运算方法，可广泛应用于合成生物学、生物计算。

A Method and Application of Gate-to-Gate Logic Operation Based on Linear Double-stranded DNA Molecular Connection

The invention discloses a gate logic operation method based on linear double-stranded DNA molecular connection. The sequence of gene expression core components containing promoter, gene coding region and poly A signal is split into two or three linear double-stranded DNA molecules as input by PCR amplification reaction and transfected into cells. When all linear double-stranded DNA molecules appear at the same time, these linear double-stranded DNA molecules form a complete sequence of core components of gene expression and realize gene expression through intracellular connection reaction, thus realizing logic operation with gate. The invention provides a low noise signal ratio and gate logic operation method based on linear double stranded DNA molecule, which can be widely used in synthetic biology and biological calculation.

【技术实现步骤摘要】
一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法及应用
本专利技术涉及合生生物领域，具体涉及一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法。
技术介绍
合成生物学(Syntheticbiology)是21世纪的新兴交叉学科，强调“设计”和“重设计”，其目的是通过人工设计和构建自然界不存在的生物系统来解决健康、环保和能源等问题。近年来诸如J.D.Keasling课题组的青蒿酸微生物合成工厂、C.A.Voigt课题组的大肠杆菌成像系统、J.C.Venter及G.Church课题组创造的新菌种等重大突破展示了合成生物学改变世界的巨大潜能。合成生物学将对人类认识生命、揭示生命奥秘、重新设计及改造生命等方面产生重大的科学意义。合成生物学的发展受到多个国家政府和研究团体的高度重视，美、欧等国均投入大量资本支持合成生物学的研究与工业化。通过前瞻性布局与重点投入，我国已成为合成生物学领域中的重要力量之一，产生了一批代表性研究成果。合成生物学的“重设计”指对模块、组件、系统的重新设计。模块“重设计”：通过对天然蛋白进行基因工程改造以产生具有新功能的蛋白分子。经典例子是通过对绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)的改造以产生系列不同吸收/发射波长的新荧光蛋白(BFP、CFP、YFP、mCherry、mTomato等)。近年来，得益于基因组学、计算机科学的快速发展，大量非天然蛋白被设计出来在医药、材料等不同领域发挥作用。2017年美国华盛顿大学的DavidBaker研究团队通过Rosetta蛋白设计模型、寡核苷酸合成技术、酵母展示筛选技术、深度测序技术，以流感病毒HA和神经毒素为靶点，设计并测试了超过两万个蛋白质抑制多肽。通过这样的从头设计策略，与以前的研究相比，他们将此类抑制多肽数量提高了两个数量级，并且这些抑制多肽非常稳定，在小鼠实验中可以很好的阻断流感病毒的传播。组件、系统“重设计”：天然存在或经重设计的模块经过重组合、重设计可形成新组件、新系统从而实现合成生物学新功能。加州大学伯克利分校J.D.Keasling教授通过将相关基因植入大肠杆菌和酿酒酵母中实现青蒿酸的微生物合成，极大提高了产量缩短了生产周期。此外通过设计基于各种“与”、“非”门逻辑的人工基因线路(artificialgeneticcircuits)，研究者实现了生物对不同刺激信号(Inputs)的不同反应(Outputs)。通过设计包含18个基因和32个调节元件的人工基因线路，麻省理工学院C.A.Voigt教授开发出大肠杆菌RGB成像系统，可通过不同逻辑门实现大肠杆菌对不同波长光刺激的不同颜色反应。通过构建人工基因线路实现精准基因表达调控，合成生物学也在疾病诊断、治疗方面展现出广阔的应用前景。例如近期麻省理工学院卢冠达课题组利用肿瘤特异性启动子(tumor-specificpromoter)、小RNA海绵(miRNAsponge)、小RNA靶向调控(miRNA-targetregulation)等基因模块(geneticmodule)设计出复杂的基于RNA的免疫调控基因线路。小鼠成瘤实验表明此基因线路可实现免疫因子的肿瘤组织特异性表达，进而诱导T细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤，从而增强免疫治疗效果。与门逻辑运算(ANDgatelogiccomputation)是一种最基本的逻辑门，指仅在所有输入信号(Inputsignal)都为阳性时，产生阳性输出信号(Outputsignal)；任何一个输入信号为阴性时，则输出信号为阴性(如图1所示)。在生物医学领域与门逻辑基因线路被用来实现“特异性”，即在所有输入信号都存在的情况下实现信号输出。现有技术中，存在的缺陷和不足主要包括：(1)现有与门逻辑基因线路构建策略较复杂，首先需要细胞表达多种蛋白或RNA分子，在此基础上通过这些分子及DNA分子之间的相互作用实现与门运算。在逻辑运算前表达蛋白或RNA分子增加了细胞的负担；(2)目前的与门逻辑基因线路设计策略无法实现高信噪比，即在[0,0][0,1][1,0]的情况下实现接近背景的信号输出，在[1,1]的情况下有较强信号输出；(3)目前的与门逻辑基因线路设计策略没有利用拆分基因表达核心组件(启动子-基因编码区-polyA信号，promoter-gene-polyAsignal)来实现高信噪比输出。
技术实现思路
本专利技术设计开发了一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，本专利技术的目的是通过线性双链DNA产物的不同组合进行与门逻辑运算进而确定线性双链DNA产物作为分子元件在细胞水平构建与门逻辑基因线路的可行性。本专利技术还提供了基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法的应用，可广泛应用于合成生物学、生物计算。本专利技术提供的技术方案为：一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，包括如下过程：通过PCR扩增反应将含有启动子、基因编码区、polyA信号的基因表达核心组件序列拆分成2～3个线性双链DNA分子作为输入，转染入细胞中；在所有线性双链DNA分子同时出现时，通过细胞内的连接反应，这些线性双链DNA分子重新形成完整的基因表达核心组件序列并进行基因表达。优选的是，包括：步骤一、以报告基因表达质粒为模板，通过PCR扩增得到含有CMV启动子序列和/或含有polyAsignal序列的多个线性双链DNA分子；步骤二、将所述线性双链DNA分子进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小切胶以去除模板质粒，产物回收后，测定浓度；步骤三、将所述线性双链DNA分子不同分组进行转染细胞，转染48小时后采用流式细胞术检测与门逻辑运算输出信号蛋白表达；当所述转染细胞同时包括所述线性双链DNA分子包含CMV启动子序列组成的DNA片段和包含polyAsignal序列组成的DNA片段时，检测到蛋白表达。优选的是，在所述步骤一中，以报告基因表达质粒为模板，分别利用序列表中的SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.1所示序列和/或序列表中的SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.2所示序列的多个线性双链DNA分子。优选的是，在所述步骤一中，以报告基因表达质粒为模板，分别利用序列表中的SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.3所示序列和/或序列表中的SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.4所示序列的多个线性双链DNA分子。优选的是，在所述步骤一中，以报告基因表达质粒为模板，分别利用序列表中的SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.5所示序列和/或序列表中的SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.6所示序列的多个线性双链DNA分子。优选的是，在所述步骤一中，以报告基因表达质粒为模板，分别利用序列表中的SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.7所示序列和/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，其特征在于，包括如下过程：通过PCR扩增反应将含有启动子、基因编码区、poly A信号的基因表达核心组件序列拆分成2～3个线性双链DNA分子作为输入，转染入细胞中；在所有线性双链DNA分子同时出现时，通过细胞内的连接反应，这些线性双链DNA分子重新形成完整的基因表达核心组件序列并进行基因表达。

【技术特征摘要】
1.一种基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，其特征在于，包括如下过程：通过PCR扩增反应将含有启动子、基因编码区、polyA信号的基因表达核心组件序列拆分成2～3个线性双链DNA分子作为输入，转染入细胞中；在所有线性双链DNA分子同时出现时，通过细胞内的连接反应，这些线性双链DNA分子重新形成完整的基因表达核心组件序列并进行基因表达。2.如权利要求1所述的基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，其特征在于，包括：步骤一、以报告基因表达质粒为模板，通过PCR扩增得到含有CMV启动子序列和/或含有polyAsignal序列的多个线性双链DNA分子；步骤二、将所述线性双链DNA分子进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小切胶以去除模板质粒，产物回收后，测定浓度；步骤三、将所述线性双链DNA分子不同分组进行转染细胞，转染48小时后采用流式细胞术检测与门逻辑运算输出信号蛋白表达；当所述转染细胞同时包括所述线性双链DNA分子包含CMV启动子序列组成的DNA片段和包含polyAsignal序列组成的DNA片段时，检测到蛋白表达。3.如权利要求2所述的基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，其特征在于，在所述步骤一中，以报告基因表达质粒为模板，分别利用序列表中的SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.1所示序列和/或序列表中的SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.2所示序列的多个线性双链DNA分子。4.如权利要求2所述的基于线性双链DNA分子连接的与门逻辑运算方法，其特征在于，在所述步骤一中，以报告基因表达质粒为模板，分别利用序列表中的SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.3所示序列和/或序列表中的SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示的引物序列通过PCR扩增得到含有序列表中的SEQIDNO.4所示序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：李帅，苏位君，张春泽，
申请(专利权)人：天津达济科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12