一种提高胎儿血红蛋白表达的方法技术

本发明专利技术涉及高效安全基因编辑造血干细胞BCL11A的增强子位点的方法，包括通过基因编辑技术破坏BCL11A基因组CTTCCT区域。本发明专利技术基因编辑后的造血干细胞具有正常细胞功能，且能显著提高胎儿血红蛋白的表达,以抵消地中海贫血患者缺失的正常血红蛋白。因此，可将基因编辑后的造血干细胞用于β‑地中海贫血和镰刀红细胞贫血的临床治疗。

A method to improve the expression of fetal hemoglobin

The invention relates to a method for efficiently and safely editing enhancer sites of BCL11A hematopoietic stem cells, including destroying the CTTCCT region of BCL11A genome by gene editing technology. The hematopoietic stem cells edited by the gene of the invention have normal cell function, and can significantly improve the expression of fetal hemoglobin to counteract the normal hemoglobin lost in thalassemia patients. Therefore, genetically edited hematopoietic stem cells can be used in the clinical treatment of beta thalassemia and sickle cell anemia.

【技术实现步骤摘要】
一种提高胎儿血红蛋白表达的方法交叉引用本申请要求享有2017年10月27日提交的中国专利申请2017110277086的优先权，该中国专利申请的公开内容以其整体通过引用并入本申请。
本专利技术涉及用于治疗地中海贫血和镰刀形红细胞贫血等贫血疾病的细胞治疗方案，其包含利用基因编辑技术，高效安全地基因修饰人的造血干细胞的BCL11A的增强子位点，尤其是通过基因编辑技术破坏造血干细胞中2号染色体上CTTCCT连续6个碱基的BCL11A基因组区域，上调γ珠蛋白和胎儿血红蛋白的表达，实现治疗疾病的目的。
技术介绍
地中海贫血又称为珠蛋白生成障碍贫血或者海洋性贫血，是一组由于基因缺陷等遗传因素导致的溶血性贫血类疾病。遗传性基因缺陷致使血红蛋白中一种或几种珠蛋白肽链合成缺失或者不足，从而导致贫血或者溶血的病理状态。合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失会导致血红蛋白结构异常，这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低，寿命减短，在骨髓中可能出现原位溶血，进入到外周血液循环后被脾脏等脏器提前破坏，致使贫血、体内铁沉积甚至发育异常。由于不同珠蛋白链基因突变的多样性和复杂性，使缺失的珠蛋白类型、数量及临床症状变异性非常大。地中海贫血根据所缺失的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。按照不同类型珠蛋白肽链生成障碍可分为α型、β型、δ型、δβ型。目前地中海贫血是全球最普遍的基因缺陷遗传性疾病之一。据统计，4.83％的全球人口携带珠蛋白突变基因，其中包括1.67％的α、β地中海贫血杂合子，同时包含1.92％携带镰刀形细胞突变的血红蛋白，0.95％携带血红蛋白E，0.29％携带血红蛋白C等。由此产生的有疾病症状的血红蛋白异常的全球人口出生率不少于0.024％，是一种常见的基因缺陷型疾病。β地中海贫血(以下简称β地贫)是地中海贫血的一种，其发病机理是因为β珠蛋白肽链发生基因突变，多数病人是点突变，少数是大片段基因缺失。基因缺失和某些点突变可以导致一部分β珠蛋白肽链的合成完全被抑制，这类称为β0地贫；而少数的点突变使β链的合成部分受到抑制，仍保留一部分肽链合成，这类称为β+地贫，不同的组合可能出现不同的临床症状。β地贫基因突变类型非常多，据统计全球约有300多种基因异常，已发现的突变点有100多种，目前国内临床报道的有28种。其中常见的突变有6种，β41-42(-TCTT缺失)，约占45％，IVS-II654(C到T点突变)，约占24％，β17(A到T点突变)，约占14％，TATA盒子-28(A到T点突变)，约占9％。Β71-72(+A插入突变)，约占2％，β26(G到A点突变)约占2％等。重型β地贫的突变基因类型有两种，其一是β纯合子，契尔氏β0与β+地贫双重杂合子，因为β珠蛋白肽链生成近于完全受到抑制，体内无法产生β珠蛋白链，由α链和β链组成的正常的血红蛋白A合成减少或消失。虽然多余的α链蛋白能与红细胞内γ链结合形成血红蛋白F，但是由于出生后，γ合成逐渐受到抑制(又称为血红蛋白链合成切换)，因此，多余的α链会沉积在红细胞内形成包涵体，附着在红细胞膜表面上，使红细胞膜特性发生改变，细胞变僵硬而导致变形能力下降，在骨髓中发生被破坏导致“无效造血”。部分地中海贫血的红细胞虽然能够在骨髓中生长发育成熟，并最终被释放到外周血循环中，但当它们通过外周局部微循环(如脾脏等脏器)时，就会因为变形能力下降，容易发生机械破坏。由于上述原因，患儿在临床上出现出生时无症状，出生后由于HbF(胎儿血红蛋白)表达而且红细胞寿命长达120天，往往当6个月后由于γ链合成被生理性抑制，血红蛋白链合成切换为β链，同时由于基因缺陷无法合成β链，细胞发生病理改变引起破坏增加，呈现慢性溶血性贫血表现，进一步导致骨髓构成改变。治疗过程中需反复输血，导致含铁血黄素沉着症，影响重要脏器功能。镰刀形红细胞贫血，与β-地中海贫血类似，都属于一种常染色体隐性遗传病，不同的是该贫血症突变位点单一，由于β珠蛋白的单一碱基突变，正常的β基因的第6位密码子由GAG(编码谷氨酸)突变为GTG(缬氨酸)所致。在突变纯合子状态，正常的α珠蛋白和异常的β珠蛋白形成四聚体复合物，称为HbS,该四聚体携带氧气的能力是正常血红蛋白的一半，在脱氧状态下聚集成多聚体，因形成的多聚体排列方向与膜平行，紧密接触细胞膜，当多聚体数量达到一定程度后，细胞膜由正常的凹形变成镰刀形。镰刀形红细胞，变形性差，容易破碎而发生溶血，造成血管堵塞，损伤，坏死等。β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血的治疗方法包括：一般支持治疗、高剂量输血及规律去铁治疗、造血干细胞移植、诱导胎儿血红蛋白药物治疗和探索性的基因治疗。目前，所有治疗方案中唯一有治愈希望的方法是异基因造血干细胞移植，自1981年托马斯进行了首例地贫患者造血干细胞移植并取得成功后，造血干细胞移植技术在全球多个地贫研究中心开展并成功取代了经典的输血和去铁的治疗方案。然而，由于HLA全相合供者严重缺乏和移植后GVHD(graft-versus-hostdisease，移植物抗宿主反应)导致的死亡，依旧限制着造血干细胞移植治疗地中海贫血的广发应用。与此同时，一直以来研究者们在持续探索治疗地中海贫血的药物，目前FDA唯一批准用于临床治疗的口服药物是羟基脲，主要通过诱导胎儿血红蛋白表达缓解疾病临床症状，但由于该药物的临床疗效不一致且存在很大的副作用，以及剂量相关的骨髓抑制，亟待开发新的治疗方法治疗β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血等相关贫血疾病。在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过提述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本专利技术的现有技术。
技术实现思路
本专利技术利用基因编辑技术，例如CRISPR/Cas9基因编辑技术，开发出了新一代的造血干细胞，该造血干细胞与现有技术的造血干细胞相比，对BCL11A增强子基因敲除的效率大大增加，从而使分化成熟后的红细胞胎儿血红蛋白的表达大大提升，一定程度上解决了现有技术中BCL11A增强子编辑效率低，胎儿血红蛋白表达量不能满足临床应用的问题。另外，本专利技术也进一步改善了对基因编辑后的造血干细胞的培养和分化策略，不仅大大缩短了从造血干细胞到成熟红细胞的分化进程，同时也使收获的成熟红细胞的数量大大增加，从而部分满足了临床应用的要求。具体地本专利技术涉及如下各项：1.一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体上从CTTCCT序列上游0-15个核苷酸至该CTTCCT序列下游0-15个核苷酸的BCL11A基因组区域，其中该BCL11A基因组区域位于chr2:60495236至chr2:60495271之间。2.项1所述的方法，其中所述BCL11A基因组区域序列为CTTCCT。3.项1或2所述的方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。4.项3所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。5.项1-4任一项所述的方法，包括向所述造血干细胞导入靶向所述BCL11A基因组区域的sgRNA以实现对所述BCL11本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体上从CTTCCT序列上游0‑15个核苷酸至该CTTCCT序列下游0‑15个核苷酸的BCL11A基因组区域，其中该BCL11A基因组区域位于chr2:60495236至chr2:60495271之间。

【技术特征摘要】
2017.10.27 CN 20171102770861.一种提高人造血干细胞胎儿血红蛋白(HbF)表达的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述造血干细胞中2号染色体上从CTTCCT序列上游0-15个核苷酸至该CTTCCT序列下游0-15个核苷酸的BCL11A基因组区域，其中该BCL11A基因组区域位于chr2:60495236至chr2:60495271之间。2.权利要求1所述的方法，其中所述BCL11A基因组区域序列为CTTCCT。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。4.权利要求3所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。5.权利要求1-4任一权利要求所述的方法，包括向所述造血干细胞导入靶向所述BCL11A基因组区域的sgRNA以实现对所述BCL11A基因组区域的编辑。6.权利要求3-5任一权利要求所述的方法，包括向所述造血干细胞导入包含选自SEQIDNOs:3、4、8和33-63任一序列的sgRNA以实现对所述BCL11A基因组区域的编辑。7.权利要求3-6任一权利要求的方法，将包含SEQIDNO：4的序列的sgRNA导入所述造血干细胞以实现对所述BCL11A基因组区域的编辑。8.权利要求5-7任一权利要求的方法，其中所述sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。9.权利要求8的方法，其中所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。10.权利要求4-9任一权利要求的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。11.权利要求10的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。12.权利要求11的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。13.一种通过CRISPR/Cas9系统体外高效编辑造血干细胞的方法，包括将靶向从CTTCCT序列上游0-15个核苷酸至该CTTCCT序列下游0-15个核苷酸的BCL11A基因组区域的sgRNA导入造血干细胞，其中该BCL11A基因组区域位于chr2:60495236至chr2:60495271之间，其中该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。14.权利要求13的方法，包括将含有选自SEQIDNO：4、8和33-63任一序列的sgRNA导入造血干细胞，其中该sgRNA是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。15.权利要求13或14的方法，其中将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。16.权利要求15的方法，其中通过电转方法将sgRNA与Cas9编码核苷酸共同导入所述造血干细胞。17.权利要求16的方法，其中所述电转条件为200-600V，0.5ms-2ms。18.通过权利要求1～17中任一权利要求所述的方法得到的造血干细胞。19.一种通过基因改造使胎儿血红蛋白(HbF)表达升高的人造血干细胞，其中该造血干细胞中第2号染色体上从CTTCCT序列上游0-15个核苷酸至该CTTCCT序列下游0-15个核苷酸的BCL11A基因组区域的sgRNA导入造血干细胞，其中该BCL11A基因组区域位于chr2:60495236至chr2:60495271之间。20.通过分化培养权利要求18或19所述的造血干细胞获得的、处于成熟红细胞之前的不同分化阶段的前体细胞。21.通过分化培养权利要求18或19所...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁鹏飞，方日国，于玲玲，夏鹏辉，王佳，梁福才，
申请(专利权)人：博雅辑因北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11