一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体制造技术

本发明专利技术提供了一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体。具体地，本发明专利技术提供了一种用于编辑昆虫细胞基因的试剂，所述试剂包括靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体。本发明专利技术的避免了使用化学农药，保护了环境，保障了食品安全，且产生的害虫不易产生耐药性。

A RISPR/Cas9 Vector for Insect Gene Editing

The invention provides a RISPR/Cas9 vector which can be used for insect gene editing. Specifically, the present invention provides a reagent for editing insect cell genes, which includes sgRNA targeting ABC transporter gene or an expression vector for expressing the sgRNA. The invention avoids the use of chemical pesticides, protects the environment, guarantees food safety, and produces pests that are not easy to produce drug resistance.

【技术实现步骤摘要】
一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体。
技术介绍
CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技术是近年发展起来的新型高效基因编辑技术，来源于对细菌免疫机制的研究。在噬菌体感染细菌的过程中，细菌把噬菌体核酸的部分片段整合到自身基因组中，并进化出Cas(CRISPR-associated)核酸酶。当噬菌体再次感染时，Cas核酸酶在这些片段(称为gRNA)的引导下结合到噬菌体核酸的相应部位并切割核酸，从而阻止噬菌体的侵染。研究人员利用此原理，发展了一种基因编辑技术，即通过gRNA引导Cas9核酸酶到目的基因的把序列上，Cas9切割双链DNA，通过非同源末端连接机制引入缺失插入等突变，从而破坏基因功能。CRISPR/Cas9基因编辑技术需要相应的载体来实现。基本过程是从化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)中得到Cas9基因序列并经过特定表达宿主密码子优化后克隆到相应的表达载体，以及克隆小RNA启动子驱动的gRNA骨架序列到同一表达载体。CRISPR/Cas9基因编辑技术对靶基因编辑位点的选择是由gRNA确定的，而gRNA的设计需要遵循一定的规则。第一，转录起始碱基为鸟嘌呤G；第二，中间序列长度为20个碱基；第三，靶基因中与上述20个碱基区域下游三碱基必须为NGG，称为PAM序列，其中N代表任一碱基。农业害虫控制是农业生产中一个非常重要的环节。对种植业来说，我国目前普遍使用化学农药，保证了粮食及果蔬的供给，但在其生产与使用过程中同样对人体健康、生态环境及物种多样性造成了深刻的影响，因此本领域迫切需要开发新的农业害虫控制手段。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种可用于昆虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于编辑昆虫细胞基因的试剂，所述试剂包括：(i)靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体；和任选的(ii)表达Cas9蛋白或表达Cas9蛋白的表达盒。在另一优选例中，所述昆虫为小菜蛾、二化螟。在另一优选例中，所述ABC转运蛋白基因为ABCH1。在另一优选例中，所述sgRNA包括含有其对应识别区序列的核苷酸。在另一优选例中，所述sgRNA的序列为sgRNA识别区序列或相应的全长sgRNA序列。在另一优选例中，所述sgRNA的序列包括选自下组的序列：(1)sgRNA识别区序列；或(2)相应的全长sgRNA序列。在另一优选例中，所述的全长sgRNA序列从5’端至3’端依次含有sgRNA识别区序列和sgRNA框架序列。在另一优选例中，所述sgRNA识别区序列具有SEQIDNO.:1(GTCGCCGCCGGGCGACGAGA)所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述sgRNA框架序列具有SEQIDNO.:2(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC)所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述sgRNA具有SEQIDNo.:3(GTCGCCGCCGGGCGACGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC)所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA为经过或未经过化学基团修饰的。在另一优选例中，所述ABC转运蛋白基因来源于昆虫，较佳地，来源于小菜蛾。在本专利技术的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有：(1)第一容器以及位于所述第一容器内的第一表达载体，所述第一表达载体含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达所述靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA；和任选的(2)第二容器以及位于所述第二容器内的第二表达载体，所述第二表达载体含有第二表达盒，所述第二表达盒用于表达Cas9蛋白的表达盒。在另一优选例中，所述靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA的识别区序列具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述第一和第二表达载体为独立的或相连的。在另一优选例中，所述第一和第二表达载体位于相同或不同的容器内。在另一优选例中，所述第一和第二表达盒位于相同或不同的载体上。在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。在另一优选例中，所述表达载体包括pAc-sgRNA-Cas9。在另一优选例中，所述表达载体的序列如SEQIDNo.:4(ggaaaaatgatgtgacagtggaaatgagaagtaggtgcatctgcaaagatttgattcagagttgatgccattcatgattttttttagaagtatcatttgtgtttttagaatatagaattaattccttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgat本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于编辑昆虫细胞基因的试剂，所述试剂包括：(i)靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体；和任选的(ii)表达Cas9蛋白或表达Cas9蛋白的表达盒。

【技术特征摘要】
1.一种用于编辑昆虫细胞基因的试剂，所述试剂包括：(i)靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA或用于表达所述sgRNA的表达载体；和任选的(ii)表达Cas9蛋白或表达Cas9蛋白的表达盒。2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述ABC转运蛋白基因为ABCH1。3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述sgRNA识别区序列具有SEQIDNO.:1所示的核苷酸序列。4.一种试剂盒，所述试剂盒含有：(1)第一容器以及位于所述第一容器内的第一表达载体，所述第一表达载体含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达所述靶向ABC转运蛋白基因的sgRNA；和任选的(2)第二容器以及位于所述第二容器内的第二表达载体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐雪明，李学文，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31