真菌宿主细胞中DNA片段的基因组整合制造技术

本发明专利技术涉及在真菌宿主细胞中的特定染色体靶位点处体内组装和整合目的多核苷酸的方法，所述方法包括用以下转化该宿主细胞：iv.至少一种多核苷酸片段，其依次包含上游侧翼区和该目的多核苷酸的5’部分；v.至少一种多核苷酸片段，其依次包含该目的多核苷酸的3’部分和下游侧翼区；和，任选地vi.一种或多种另外的多核苷酸片段，每种多核苷酸片段包含该目的多核苷酸的5’部分和3’部分；其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至少20bp的重叠，因此这些片段覆盖整个目的多核苷酸，并且其中这些侧翼区具有足够的大小和同源性以实现与该特定靶位点的同源重组，用于染色体整合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真菌宿主细胞中DNA片段的基因组整合对序列表的引用本申请含有一个计算机可读形式的序列表。将该计算机可读形式通过引用结合在此。
本专利技术涉及在真菌宿主细胞中的特定染色体靶位点处体内组装和整合目的多核苷酸的方法，所述方法包括用以下转化该宿主细胞：i.至少一种多核苷酸片段，其依次包含上游侧翼区和该目的多核苷酸的5’部分；ii.至少一种多核苷酸片段，其依次包含该目的多核苷酸的3’部分和下游侧翼区；和，任选地iii.一种或多种另外的多核苷酸片段，每种多核苷酸片段包含该目的多核苷酸的5’部分和3’部分；其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至少20bp的重叠，因此这些片段覆盖整个目的多核苷酸，并且其中这些侧翼区具有足够的大小和同源性以实现与该特定靶位点的同源重组，用于染色体整合。
技术介绍
已经披露了用于使用位点特异性重组酶将目的多核苷酸文库重组到丝状真菌宿主细胞的染色体中的方法(WO2016/026938)。披露了一种有效的名为双分裂标记系统(DSMS)用于位点特异性和定向染色体整合，其中使启动子以及亚硝酸盐还原酶(niiA)基因和硝酸盐还原酶(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在真菌宿主细胞中的特定染色体靶位点处体内组装和整合目的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)用以下转化该宿主细胞：iv.至少一种多核苷酸片段，其依次包含上游侧翼区和该目的多核苷酸的5’部分；v.至少一种多核苷酸片段，其依次包含该目的多核苷酸的3’部分和下游侧翼区；和，任选地vi.一种或多种另外的多核苷酸片段，每种多核苷酸片段包含该目的多核苷酸的5’部分和3’部分；其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至少20bp的重叠，因此这些片段覆盖整个目的多核苷酸，并且其中这些侧翼区具有足够的大小并且与该特定染色体靶位点具有足够的同源性以实现与...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.15 EP 16189049.61.一种用于在真菌宿主细胞中的特定染色体靶位点处体内组装和整合目的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)用以下转化该宿主细胞：iv.至少一种多核苷酸片段，其依次包含上游侧翼区和该目的多核苷酸的5’部分；v.至少一种多核苷酸片段，其依次包含该目的多核苷酸的3’部分和下游侧翼区；和，任选地vi.一种或多种另外的多核苷酸片段，每种多核苷酸片段包含该目的多核苷酸的5’部分和3’部分；其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至少20bp的重叠，因此这些片段覆盖整个目的多核苷酸，并且其中这些侧翼区具有足够的大小并且与该特定染色体靶位点具有足够的同源性以实现与该特定靶位点的同源重组；b)在有利于体内同源重组发生的条件下培养该转化的宿主细胞，其中重叠PCR片段重组以形成整个目的多核苷酸，并且这些侧翼区与该染色体重组以在该特定染色体靶位点处整合该目的多核苷酸；和c)选择经转化的宿主细胞，其中该目的多核苷酸被整合到该特定染色体靶位点中。2.如权利要求1所述的方法，其中该真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞，优选地该丝状真菌宿主细胞是以下属的：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉宿主细胞。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该真菌宿主细胞具有非同源末端连接修复缺陷；优选地，该宿主细胞包含非同源末端连接修复所需的基因中的失活性突变或缺失；更优选地，该宿主细胞包含kusA、ligD、ku70、ku80、mre11、rad50、和/或xrs2，或其进化同系物中的失活性突变；更优选地，该真菌宿主细胞中缺失kusA、ligD、ku70、ku80、mre11、rad50、和/或xrs2，或其进化同系物。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至多1,000bp，优选地至多900bp，至多800bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·M·K·克里特加德，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK