基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法技术方案

本发明专利技术公开了基于piggyBAC‑Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：将Cas9/gRNA表达元件片段及抗性筛选片段构建在一个载体表达；将上述载体和piggyBAC表达质粒共电转染到目标细胞中，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，挑单克隆进行培养；选前述的单克隆培养细胞进行PCR扩增，确认实际基因组序列；最后切除Cas9/gRNA表达元件。本发明专利技术的构件方法应用piggyBAC转作系统，在整合后还可以进行移除，实现无痕基因敲除。

Construction of gene knockout cell lines based on piggyBAC-Cas9 system

The invention discloses a method for constructing gene knockout cell lines based on piggyBAC Cas9 system, including the following steps: constructing Cas9/gRNA expression element fragments and resistance screening fragments to express in a vector; co-electronically transfecting the above vector and piggyBAC expression plasmid into target cells, screening transfected cells with a culture medium containing corresponding resistance components, and selecting monoclones for culture. The above-mentioned monoclonal cultured cells were selected for PCR amplification to confirm the actual genome sequence. Finally, Cas9/gRNA expression elements were removed. The component method of the invention applies the piggyBAC conversion system and can be removed after integration to realize traceless gene knockout.

【技术实现步骤摘要】
基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法
本专利技术属于生物基因
，具体涉及基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法。
技术介绍
基因敲除细胞株模型是开展基因功能研究、靶点验证及药物筛选的重要工具。CRISPR/Cas9技术的出现，大大的提高了基因编辑的便利性，使得基因敲除细胞株的成功率大大提高。CRISPR/Cas9是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到基因组DNA进行修饰的目的。目前主要有病毒法和电转法两种方式构建基因敲除细胞株。但这两种方法都有一定的局限性。病毒法通常将hCas9表达元件和U6-gRNA元件插入到病毒载体中，比如慢病毒载体。通过慢病毒感染细胞的方式将hCas9和gRNA元件导入细胞，并整合到基因组中。hCas9和gRNA持续表达，当和靶序列结合时进行切割，实现基因的敲除。病毒法优点：(1)很多细胞系转染困难，病毒感染的方式能够实现高效的细胞转染；(2)慢病毒将hCas9表达元件和U6-gRNA元件整合到基因组中，hCas9和gRNA持续表达和DNA切割，基因敲除效率很高，对于多倍体细胞(比如很多肿瘤细胞系)，慢病毒法基因敲除的纯合阳性率比电转法高；(3)载体中携带抗性基因，可以通过抗性筛选，去除部分野生型细胞，提高单克隆鉴定的阳性率。但是，病毒法还具有如下缺点：(1)慢病毒可能在基因组中整合多个拷贝，可能会影响到内源基因表达，也可能会造成基因组的不稳定；(2)hCas9和gRNA持续表达提高了脱靶风险；(3)病毒感染可能会影响细胞的状态，引起细胞老化；(4)步骤繁琐：需要构建慢病毒载体，并进行病毒包装，整个敲除细胞系的构建周期可能长达3-5个月，而且价格很昂贵；(5)一旦基因整合后无法去除。电转法是直接体外合成tracrRNA和crRNA。Cas9蛋白和tracrRNA/crRNA体外孵育形成RNP复合体。通过电转的方式将RNP复合体转入细胞中，对基因组进行编辑。电转法的优点包括：(1)步骤简单，周期短，价格便宜。不需要进行载体构建和病毒包装，快速获得基因敲除的细胞株；(2)避免了慢病毒基因组整合的忧虑；(3)RNP复合体很快降解，脱靶效率比慢病毒法低。但是，电转法还具有如下缺点：(1)RNP复合体孵育形成后活性很高，随时间延长，活性逐渐降低。对1-2个拷贝的基因能够高效的进行编辑。但是很多癌细胞系都是多倍体核型，基因敲除时需要同时敲除多个位点，这种情况下RNP复合体敲除效率有可能很低；(2)对于转染困难的细胞，RNP转入的效率低，影响基因敲除效率；(3)没有抗性筛选，当转染效率低时，野生型细胞存在降低纯合克隆阳性率。
技术实现思路
针对上述现有技术对癌细胞系进行基因编辑需求越来越多，急需一种能够高效无痕基因敲除的方法，基于此，本专利技术提供了一种piggyBAC-Cas9基因敲除系统，实现了高效无痕基因敲除。为达到上述目的，本专利技术提供的技术方案是基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：(1)载体构建:将Cas9/gRNA表达元件片段及抗性筛选片段构建在一个载体表达；(2)质粒电转染和单克隆将上述载体和piggyBAC表达质粒共电转染到目标细胞中，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，pBase表达后将ITR之间序列转座插入基因组，Cas9和gRNA持续表达，进行基因组编辑，挑单克隆进行培养；(3)阳性克隆鉴定选前述的单克隆培养细胞进行PCR扩增，以鉴定目标基因是否敲除成功，对阳性克隆进行测序验证，确认实际基因组序列；(4)切除Cas9/gRNA表达元件将pBase-MU质粒电转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间的序列整体切除，原位点不残余任何序列，通过PCR和测序验证，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。本专利技术优选的技术方案中，步骤(1)中，所述抗性筛选片段选自嘌呤霉素Puromycin、潮霉素Hygromycin、新霉素Neo或G418抗生素序列片段。本专利技术优选的技术方案中，步骤(1)中构建的载体中，抗性筛选片段具有单独的启动子，所述启动子优选为PGK、CMV。本专利技术优选的技术方案中，步骤(2)中，所述目标细胞选自哺乳动物细胞，包括ATCC细胞库、中科院细胞库以及基于细胞库修改后的细胞株，基于ATCC细胞库修改后的动物细胞株。本专利技术优选的技术方案中，步骤(2)中，piggyBAC表达质粒来自SBI公司的PB210PA-1产品。本专利技术优选的技术方案中，步骤(4)中，pBase-MU质粒来自SBI公司的PB220PA-1产品。本专利技术的基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的优点包括：(1)本专利技术的构件方法piggyBAC-Cas9基因敲除系统通过荧光标记，可以直接可视化的筛选出piggyBAC-Cas9表达克隆，大大降低筛选工作量。而现有技术的基因敲除阳性率低，需要进行单克隆的大量筛选鉴定。单克隆培养和筛选鉴定的周期和成本都很高。病毒法做基因敲除时，可以通过抗性进行筛选富集阳性细胞，降低野生型背景。而电转法直接电转Cas9和gRNA，不能进行药筛。有很多野生型细胞正常生长甚至生长状况更好，片段敲除效率和基因敲除纯合阳性率很低。piggyBAC-Cas9系统综合两者的优点，能够像病毒法一样进行药物筛选，杀伤野生型细胞，提高基因敲除纯合阳性率。(2)本专利技术的构件方法引入piggyBAC转座系统，能够实现基因组整合，长期表达Cas9和gRNA，持续对基因组进行编辑。对于癌细胞系多倍体核型，需要进行多点同时编辑，而现有技术的电转法RNP复合体很快降解，不能有效对多位点就行编辑。Cas9活性：电转法Cas9/RNP复合体孵育形成后活性很高，随时间延长，活性逐渐降低。对一个位点进行Cas9切割时活性较高，但多个位点切割时效率非常低。然而大多数肿瘤细胞系都是多倍体，使用电转法进行基因敲除时纯合克隆阳性率低。慢病毒法将Cas9和gRNA整合进基因组中，两者持续表达，持续进行基因编辑。基因敲除纯合克隆阳性率很高，但是Cas9和gRNA无法去除，脱靶风险很高。piggyBAC-Cas9系统在两者之间取得一个平衡，和病毒法类似Cas9和gRNA整合进基因组中，片段敲除效率和基因敲除纯合阳性率较高，足够进行多位点的切割，适合大片段、多基因、多拷贝基因敲除项目。能够通过转突变型pBase将整合的Cas9和gRNA切除，降低了脱靶风险。(3)本专利技术的构件方法应用piggyBAC转作系统，在整合后还可以进行移除，实现无痕基因敲除。而现有技术的慢病毒法整合到基因组中，可能会造成染色体不稳定，或影响其他基因的表达等副面影响。病毒法将Cas9和gRNA整合进基因组，并持续表达，无法去除。电转法没有引入其他序列，且Cas9作用时间短，脱靶很低。piggyBAC-Cas9系统虽然开始将Cas9和gRNA整合进基因组中，但后续可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于piggyBAC‑Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：(1)载体构建:将Cas9/gRNA表达元件片段及抗性筛选片段构建在一个载体表达；(2)质粒电转染和单克隆将上述载体和piggyBAC表达质粒共电转染到目标细胞中，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，pBase表达后将ITR之间序列转座插入基因组，Cas9和gRNA持续表达，进行基因组编辑，挑单克隆进行培养；(3)阳性克隆鉴定选前述的单克隆培养细胞进行PCR扩增，以鉴定目标基因是否敲除成功，对阳性克隆进行测序验证，确认实际基因组序列；(4)切除Cas9/gRNA表达元件将pBase‑MU质粒电转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间的序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。

【技术特征摘要】
1.基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，包括如下步骤：(1)载体构建:将Cas9/gRNA表达元件片段及抗性筛选片段构建在一个载体表达；(2)质粒电转染和单克隆将上述载体和piggyBAC表达质粒共电转染到目标细胞中，用含有对应抗性成分的培养基筛选被转染的细胞，pBase表达后将ITR之间序列转座插入基因组，Cas9和gRNA持续表达，进行基因组编辑，挑单克隆进行培养；(3)阳性克隆鉴定选前述的单克隆培养细胞进行PCR扩增，以鉴定目标基因是否敲除成功，对阳性克隆进行测序验证，确认实际基因组序列；(4)切除Cas9/gRNA表达元件将pBase-MU质粒电转入阳性克隆中，在突变型pBase的作用下将ITR之间的序列整体切除，原位点不残余任何序列，确认切除成功后，对阳性克隆进行冻存。2.根据权利要求1所述基于piggyBAC-Cas9系统构建基因敲除细胞株的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗性筛选片段选自嘌呤霉素、潮霉素、新霉素或G418抗生素序列片段。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：郑敦武，段伟婷，程冬洋，
申请(专利权)人：郑敦武，太仓超云生物信息咨询服务有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32