一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法。本发明专利技术针对siRNA

【技术实现步骤摘要】
一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法，属于医药制剂


技术介绍

[0002]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引发的特定基因沉默机制，即利用具有21至23个核苷酸的短双链RNA以高度序列特异性的方式抑制基因表达。RNAi疗法已被证明可以治疗人类疾病和植物病毒等。然而，在实际应用过程中，基因治疗存在的最大障碍是缺少安全、高效的载体系统。因此，提供一种安全性高，具有靶向性，转染效率好的脂质纳米粒是本专利技术要完成的任务。脂质纳米粒是一种具有生物膜结构的球形或近似球形的囊泡，通常由一个或多个磷脂双分子层或薄层构成，脂质纳米粒是指粒径在纳米级的脂质体，作为载体具有更大的表面积，从而在生物相容性、生物利用度和缓释性能等方面更具优势，因此它可以被用来递送多种活性成分，包括化疗药物、反义寡核苷酸、DNA、siRNA、抗原和蛋白质。脂质纳米粒的内部与外部均为亲水相，磷脂双分子层中为亲油相，药物可根据其极性包裹于磷脂双分子中或内外水相中。目前常用过膜挤压法、乙醇注射技术等方法制备脂质纳米粒。制备过程中，水相溶液、油相溶液和稀释相以一定配比体积同时挤出，活性成分和各种脂质分子即可在静电吸引力与亲疏水作用力下包裹活性成分形成脂质纳米粒。但由于人工制备方法操作复杂，实验重复性差等缺点，因此急需一种稳定、可控、简易的操作方法来提高制备过程的可重复性和实现对粒径的可靠调控。
[0003]目前脂质纳米粒在mRNA疫苗应用中的成功，但组分配方浓度不适用于siRNA。针对不同类型的RNA需要不同磷脂比的浓度，且目前制备脂质体囊泡的微流控装置未能在脂质纳米粒的制备上达到良好应用和预期效果。现实验室中脂质纳米粒制备过程仍然依靠人工操作，且至今鲜有报道关于稳定siRNA
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LNP的微流控制备方案。因此，开发出能够制备大量、性质稳定、粒径均一的siRNA
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LNP的装置和方法是发展核酸药物需要解决的一大问题。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法。针对siRNA
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LNP制备过程与一般脂质体制备过程的差异，在装置上加入了缓冲相通道，可提高有机相和水相溶液混合效率、提升siRNA
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LNP制备过程的可重复性并改善操作精确性，制备出粒径分布均匀、稳定性高的siRNA
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LNP，同时，通过改变水相和稀释相的条件，其与siRNA混合后可以包封siRNA，并以较高的转染率向体内的细胞中递送siRNA，并可避免siRNA在转染前在体内降解。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
[0006]S1、将ALC
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0315、ALC
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0159、DSPC和Chol溶解于乙醇中配制成油相溶液，其中ALC
‑
0315、ALC
‑
0159、DSPC和Chol的浓度分别为8.0～9.0mg/mL、0.5～1.5mg/mL、1.5～2.0mg/
mL、3.5～4.5mg/mL；
[0007]S2、将siRNA加入到乙酸
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乙酸钠缓冲液中混匀，得到水相溶液；
[0008]S3、以乙酸
‑
乙酸钠缓冲液作为稀释相溶液；
[0009]S4、将油相、水相和稀释相注射至微流控装置中制备包封siRNA的脂质纳米粒；
[0010]其中，所述微流控装置由微流控芯片、微型注射泵系统和硅胶管路组成，微型注射泵系统通过硅胶管路与微流控芯片连接；所述微流控芯片包括依次串联的水相溶液入口、油相溶液入口和稀释相溶液入口，还包括混合通道和一个出口。
[0011]进一步地，水相溶液、油相溶液和稀释相溶液的流速比例为1:1:2。
[0012]进一步地，S1步骤中ALC
‑
0315、ALC
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0159、DSPC和Chol的总质量与S2步骤中siRNA的质量比为15～16：1。
[0013]进一步地，S2步骤中，所述乙酸
‑
乙酸钠缓冲液的浓度为0.5～1.5mol
·
L
‑1。
[0014]进一步地，S2步骤中，所述乙酸
‑
乙酸钠缓冲液的pH为4.6～5.0。
[0015]进一步地，S3步骤中，所述乙酸
‑
乙酸钠缓冲液的浓度为0.5～1.5mol
·
L
‑1。
[0016]进一步地，S3步骤中，所述乙酸
‑
乙酸钠缓冲液的pH为4.6～5.0。
[0017]进一步地，所述微型注射泵系统包括单通道智能注射泵、智能注射泵控制器和注射器，注射器的注射口通过硅胶管路分别与微流控芯片上的水相溶液入口、油相溶液入口和稀释相溶液入口相连，注射器的与单通道智能注射泵连接，注射泵通过智能注射泵控制器控制泵速。
[0018]进一步地，所述硅胶管路为内径＜0.2mm的管路。
[0019]进一步地，所述制备方法还包括采用层析法去除乙醇的步骤。
[0020]本专利技术的有益效果是：
[0021]阳离子脂质ALC
‑
0315可与带负电荷的无义siRNA通过静电作用紧密结合，形成脂质体与核酸的复合物，具有高效的体外转染效率；同时复合物也易于与带负电荷的细胞表面结合，有利于将siRNA通过细胞膜融合或者受体介导的胞吞作用递送入细胞内；ALC
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0159可以提高脂质体的稳定性和循环；DSPC和胆固醇可以提高脂质体的稳定性和膜融合，同时使得siRNA与脂质体结合的更加牢固，从而提高转染效率。本专利技术充分利用各种脂质的优势，优化脂质体配方及制备条件，本专利技术制备得到的包封siRNA的脂质体，转染效果好，能使siRNA高比率快速到达靶部位发挥作用，脂质体与siRNA结合牢固，作为药物在放置过程中稳定性好，毒副作用低。
[0022]并且，本专利技术首次采用微流控技术制备siRNA
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LNP，通过特殊设计的三相微流控芯片管路，能够实现原料间稳定、可控的混合，实现siRNA
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LNP制备过程的自动化，进一步通过优化各相参数，该方法可提升siRNA
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LNP制备的可重复性，改善操作精确性，可制备尺寸可控、粒径分布更均一的siRNA
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LNP。本申请设计的微流控芯片，水相与油相优先混合制备siRNA
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LNP，再经过稀释相稀释后通过两个并联的通道进一步混合，可提高样品的均匀度，进而提高siRNA载药量。
附图说明：
[0023]图1为微流控装置图；
[0024]图2为实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包封siRNA的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将ALC
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0315、ALC
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0159、DSPC和Chol溶解于乙醇中配制成油相溶液，其中ALC
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0315、ALC
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0159、DSPC和Chol的浓度分别为8.0～9.0mg/mL、0.5～1.5mg/mL、1.5～2.0mg/mL、3.5～4.5mg/mL；S2、将siRNA加入到乙酸
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乙酸钠缓冲液中混匀，得到水相溶液；S3、以乙酸
‑
乙酸钠缓冲液作为稀释相溶液；S4、将油相、水相和稀释相注射至微流控装置中制备包封siRNA的脂质纳米粒；其中，所述微流控装置由微流控芯片、微型注射泵系统和硅胶管路组成，微型注射泵系统通过硅胶管路与微流控芯片连接；所述微流控芯片包括依次串联的水相溶液入口、油相溶液入口和稀释相溶液入口，还包括混合通道和一个出口。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，水相溶液、油相溶液和稀释相溶液的流速比例为1:1:2。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1步骤中ALC
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0315、ALC
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0159、DSPC和Chol...

【专利技术属性】
技术研发人员：高颖，马樱芳，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：