【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物农药，具体涉及一种纳米核酸农药、其制备方法和应用、以及核酸递送系统。
技术介绍
1、脂质体是目前核酸递送的主要递送体系。磷脂化合物通常性质不稳定，易氧化变质；人工设计合成的阳离子脂质，合成步骤复杂繁琐，价格昂贵且不易获得。因此均不适合在农药领域进行大范围推广使用。
2、cn111296426a公开了以非磷脂类脂质体作为载体的纳米农药剂型的制备方法及其应用，采用单链烷基化的两亲化合物和甾醇类化合物通过自组装行为形成高稳定性的纳米分散剂，但其中作为单链烷基类两亲化合物代表的载体化合物十八胺具有一定的刺激性，并且杀菌作用较弱；而且，其采用的反复冻融法较为繁琐复杂，且生成的纳米粒不够均匀，不太适合扩大生产。
3、季铵盐又称四级铵盐，作为常用的杀菌物质，携带有正电荷，可以通过静电作用吸附携带负电荷的核酸，并形成纳米粒。而在纳米粒发生降解时，同时可以发挥杀菌作用。因此季铵盐是一种理想的核酸递送载体物质。
4、微流控技术能精准控制层流液体或液滴的混合效应，可实现传统常规液体混合方法难以完成的纳米粒制备，在核酸疫苗和核酸药物领域得到了很好的应用。但鲜有报道将其应用于农业领域。
技术实现思路
1、针对现有技术中所存在的纳米农药方面的不足，本专利技术旨在提供一种低毒高效且低成本的核酸纳米农药。
2、为实现上述目的，本专利技术的第一个方面，提供了一种纳米核酸农药的制备方法，所述制备方法是以双链或三链季铵盐与甾醇类化合物的脂质混合物作为递送
3、所述脂质混合物中，双链或三链季铵盐与甾醇类化合物的摩尔比为1:9～9:1；所述核酸与所述脂质混合物的质量百分比为0.5～20％。
4、根据本专利技术，所述核酸为核糖核酸、脱氧核糖核酸以及核酸类似物中的一种或多种，优选为具有农用或兽用rna干扰作用的脱氧核糖核酸。
5、优选的，所述核酸选自：npfr dsrna、cact::snap dsrna、pat1::pat2 dsrna、以及tmv-cp(i)-dsrna。
6、根据本专利技术，所述核酸溶液为核酸溶解于纯水、缓冲溶液、酸性溶液、以及中性溶液中的一种或多种的混合物而得到的溶液。
7、根据本专利技术，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、三羟甲氨基甲烷缓冲溶液、巴比妥缓冲液、甲酸钠缓冲液、或醋酸-锂盐缓冲液。
8、根据本专利技术，所述双链或三链季铵盐具有以下结构式：
9、
10、其中：
11、r1和r2分别为10～20个碳的长链烷基基团；
12、r3为10～20个碳的烷基基团，或者为1～3个碳的烷基基团；
13、r4为1～3个碳的烷基基团；
14、x为卤素，包括氟、氯、溴、碘。
15、根据本专利技术，所述甾醇类化合物选自：胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、燕麦甾醇、麦角甾醇、芦竹甾醇、甲基甾醇、异岩藻甾醇、环木菠萝烷醇、环木菠萝烯醇、2,4-亚甲基环木菠萝醇、禾本甾醇、柠檬甾二烯醇、β-谷甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯、洛飞烯醇、斑鸠甾醇、羊毛固醇、胆固醇硫酸酯钠盐、二氢胆固醇、表二氢胆甾醇、糞甾烷醇、7-去氢胆固醇、胆汁酸、以及胆固醇酯中的一种或多种的混合物。
16、根据本专利技术，所述双链或三链季铵盐和甾醇类化合物是共同作为载体化合物溶解于有机溶剂中，所述有机溶剂选自：甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、丙烯醇、甲醛、乙醛、丙醛、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、乙二酸、丙二酸、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、二氧六环、羟基丙酸、乙胺、乙二胺、以及吡啶中的一种或多种的混合物。
17、根据本专利技术，所述的脂质混合物和核酸溶液的混合速度为5～300毫升/分钟。
18、本专利技术的第二个方面，提供了上述方法制备得到的纳米核酸农药。
19、本专利技术的第三个方面，提供了所述纳米核酸农药用于防治植物病虫害的应用。
20、本专利技术的第四个方面，提供了一种基于脂质体的核酸递送系统，所述核酸递送系统为双链或三链季铵盐以及甾醇混合物的脂质混合物。
21、优选的，所述脂质混合物中，双链或三链季铵盐与甾醇类化合物的摩尔比为1:9～9:1。
22、根据本专利技术的优选实施例，所述双链或三链季铵盐具有以下结构式：
23、
24、其中：
25、r1和r2分别为10～20个碳的长链烷基基团；
26、r3为10～20个碳的烷基基团，或者为1～3个碳的烷基基团；
27、r4为1～3个碳的烷基基团；
28、x为卤素，包括氟、氯、溴、碘。
29、根据本专利技术，所述甾醇类化合物选自：胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、燕麦甾醇、麦角甾醇、芦竹甾醇、甲基甾醇、异岩藻甾醇、环木菠萝烷醇、环木菠萝烯醇、2,4-亚甲基环木菠萝醇、禾本甾醇、柠檬甾二烯醇、β-谷甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯、洛飞烯醇、斑鸠甾醇、羊毛固醇、胆固醇硫酸酯钠盐、二氢胆固醇、表二氢胆甾醇、糞甾烷醇、7-去氢胆固醇、胆汁酸、以及胆固醇酯中的一种或多种的混合物。
30、根据本专利技术，所述双链或三链季铵盐以及甾醇混合物的脂质混合物是以双链或三链季铵盐和甾醇类化合物共同作为载体化合物溶解于有机溶剂中而得到。
31、优选的，所述有机溶剂选自：甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、丙烯醇、甲醛、乙醛、丙醛、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、乙二酸、丙二酸、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、二氧六环、羟基丙酸、乙胺、乙二胺、以及吡啶中的一种或多种的混合物。
32、本专利技术的第五个方面，提供了所述核酸递送系统用于制备纳米核酸农药的应用。
33、本专利技术具有以下有益效果：
34、1、本专利技术采用双链或三链季铵盐与甾醇混合物的脂质混合物作为核酸递送载体，核酸作为活性物质，以微流控方法进行核酸脂质纳米粒的制备，能够得到具有更好分散均一性和稳定性的纳米核酸农药。
35、2、本专利技术的核酸脂质纳米粒以及基于脂质体的递送系统，采用双链或三链季铵盐作为阳离子物质，相比单链季铵盐具有更好的成囊性，及降低表面张力的效果，也具有更低的毒性。
36、3、本专利技术的原料成本低廉，是一种非常适用于农化应用领域的纳米核酸农药，并且具有杀虫或杀菌的增效作用。
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1.一种纳米核酸农药的制备方法，其特征在于，所述制备方法是以双链或三链季铵盐与甾醇类化合物的脂质混合物作为递送载体，采用微流控设备与核酸溶液进行混合，从而得到作为纳米核酸农药的核酸脂质纳米粒，其中：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为核糖核酸、脱氧核糖核酸以及核酸类似物中的一种或多种，优选的，所述核酸选自：NPFR dsRNA、cact::snap dsRNA、PAT1::PAT2 dsRNA、以及TMV-cp(I)-dsRNA。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸溶液为核酸溶解于纯水、缓冲溶液、酸性溶液、以及中性溶液中的一种或多种的混合物而得到的溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、三羟甲氨基甲烷缓冲溶液、巴比妥缓冲液、甲酸钠缓冲液、或醋酸-锂盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双链或三链季铵盐具有以下结构式：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甾醇类化合物
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法制备得到的纳米核酸农药。
8.根据权利要求7所述的纳米核酸农药的应用，其特征在于，用于防治植物病虫害。
9.一种基于脂质体的核酸递送系统，其特征在于，所述核酸递送系统为双链或三链季铵盐以及甾醇混合物的脂质混合物，优选的，所述脂质混合物中，双链或三链季铵盐与甾醇类化合物的摩尔比为1:9～9:1。
10.根据权利要求9所述的核酸递送系统，其特征在于，所述双链或三链季铵盐具有以下结构式：
11.根据权利要求9所述的核酸递送系统，其特征在于，所述甾醇类化合物选自：胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、燕麦甾醇、麦角甾醇、芦竹甾醇、甲基甾醇、异岩藻甾醇、环木菠萝烷醇、环木菠萝烯醇、2,4-亚甲基环木菠萝醇、禾本甾醇、柠檬甾二烯醇、β-谷甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯、洛飞烯醇、斑鸠甾醇、羊毛固醇、胆固醇硫酸酯钠盐、二氢胆固醇、表二氢胆甾醇、糞甾烷醇、7-去氢胆固醇、胆汁酸、以及胆固醇酯中的一种或多种的混合物。
12.根据权利要求9所述的核酸递送系统，其特征在于，双链或三链季铵盐以及甾醇混合物的脂质混合物是以双链或三链季铵盐和甾醇类化合物共同作为载体化合物溶解于有机溶剂中而得到，优选的，所述有机溶剂选自：甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、丙烯醇、甲醛、乙醛、丙醛、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、乙二酸、丙二酸、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、二氧六环、羟基丙酸、乙胺、乙二胺、以及吡啶中的一种或多种的混合物。
13.根据权利要求9～12中任一项所述的基于脂质体的核酸递送系统的应用，其特征在于，用于制备纳米核酸农药。
...【技术特征摘要】
1.一种纳米核酸农药的制备方法，其特征在于，所述制备方法是以双链或三链季铵盐与甾醇类化合物的脂质混合物作为递送载体，采用微流控设备与核酸溶液进行混合，从而得到作为纳米核酸农药的核酸脂质纳米粒，其中：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为核糖核酸、脱氧核糖核酸以及核酸类似物中的一种或多种，优选的，所述核酸选自：npfr dsrna、cact::snap dsrna、pat1::pat2 dsrna、以及tmv-cp(i)-dsrna。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸溶液为核酸溶解于纯水、缓冲溶液、酸性溶液、以及中性溶液中的一种或多种的混合物而得到的溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、三羟甲氨基甲烷缓冲溶液、巴比妥缓冲液、甲酸钠缓冲液、或醋酸-锂盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双链或三链季铵盐具有以下结构式：
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甾醇类化合物选自：胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、燕麦甾醇、麦角甾醇、芦竹甾醇、甲基甾醇、异岩藻甾醇、环木菠萝烷醇、环木菠萝烯醇、2,4-亚甲基环木菠萝醇、禾本甾醇、柠檬甾二烯醇、β-谷甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯、洛飞烯醇、斑鸠甾醇、羊毛固醇、胆固醇硫酸酯钠盐、二氢胆固醇、表二氢胆甾醇、糞甾烷醇、7-去氢胆固醇、胆汁酸、以及胆固醇酯中的一种或多种的混合物。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法制备得到的纳米核酸农药。
【专利技术属性】
技术研发人员：陆一鸣，高颖，严雪芳，龙雨，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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