本发明专利技术公开了一种新型Methyltransferase like 21E(Mettl21e)基因敲除小鼠模型的创建方法，属于病理动物模型的药理用途领域。本发明专利技术通过TALEN技术，使Mettl21e基因DNA序列发生移码突变，从而蛋白质发生相应的移码突变，导致提前产生终止密码子，结果建立了Mettl21e基因敲除小鼠模型，由于Mettl21e与糖尿病、肥胖疾病密切相关，表明其可用于建立糖脂代谢紊乱疾病的小鼠模型。
Establishment of a New Mettl21e Gene Knockout Mice Model
The invention discloses a method for creating a novel methyltransferase like 21E (Mettl21e) gene knockout mouse model, which belongs to the pharmacological field of pathological animal models. The present invention uses TALEN technology to make the DNA sequence of Mettl21e gene shift mutation, which results in the corresponding protein shift mutation, leading to the early generation of termination codon. As Mettl21e gene knockout mouse model is closely related to diabetes and obesity diseases, it can be used to establish a mouse model of glycolipid metabolic disorders.
【技术实现步骤摘要】
一种新型Mettl21e基因敲除小鼠模型的创建
本专利技术涉及一种新型Methyltransferaselike21E(Mettl21e)基因敲除小鼠模型的创建，并涉及其在制作糖尿病、肥胖等病理模型的用途，属于病理模型的药理用途领域。
技术介绍
随着人们生活条件的逐步改善，糖尿病在中国的发生率逐年增加，国内的患病人数已经成为世界首位。因此糖尿病已成为倍受关注的公共卫生问题。骨骼肌在调控系统能量稳态上起着至关重要的的作用。一方面骨骼肌自身发生物质代谢如糖代谢等调控系统能量稳态；另一方面骨骼肌能分泌肌因子作用于脂肪、肝脏等器官调节系统能量稳态。关于Mettl21e相关功能至今上尚未见报道，本课题组前期研究发现Mettl21e在肌肉中高表达，与糖脂代谢有着密切的关系。也有研究发现糖尿病和肥胖患者体内改甲基化转移酶表达下调，将Myostatin敲除后该基因表达显著上调。因此，Mettl21e可能与骨骼肌的物质代谢有密切的关系。本专利技术利用技术创建了Mettl21e敲除小鼠动物模型，本专利技术解决了筛选出对该靶点发挥作用药物的问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种新的糖脂代谢紊乱的小鼠模型。本专利技术的主要目的是通过以下技术方案来实现的：目标基因的TALEN/CRISPR靶点的设计和体外构建：针对每个基因，根据目标基因的基因组序列，设计TALEN靶点位置。TALEN靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，不在最后一个exon上，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。每个基因设计并构建TALEN/CRISPR靶点各2-3个。目标基因TALEN/CRISPR细胞活性的验证：将构建好的TALEN/CRISPR质粒对，进行SSA活性检测。选择活性高的TALEN/CRISPR用于后续基因敲除小鼠构建。第一：TALEN/CRISPRmRNA显微注射，构建带有基因突变的小鼠(时间周期：2-3个月。)一共出生27只小鼠，两周龄后，剪取4周龄出生小鼠任一只耳朵大约三分之一，提取基因组DNA。以此基因组DNA为模板进行PCR反应，将产物进行测序。通过测序图可分析小鼠的突变情况：如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序峰在预定位置出现双峰且2种峰恰好对应不同的突变类型则该小鼠为Mettl21e基因敲除首建鼠(Founder)。第二：将带有突变的首建者小鼠(founder)与野生型C57小鼠交配，出生的小鼠两周龄后按上述方法进行基因型鉴定。得到基因突变的杂合子小鼠(+/-)F1代，并进行DNA测序，确认目标基因发生了移码突变，从而目标蛋白被缺失实现基因敲除。(时间周期：3-4个月。)第三：基因型相同的杂合子小鼠(+/-)相互交配，得到基因敲除的纯合子小鼠(-/-)F2代。如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序图出现双峰则该小鼠为杂合子；如果测序图也是单峰但是在预期位置出现缺失突变则该小鼠为纯合基因敲除小鼠，建立稳定遗传F1代小鼠品系，从而可以应用于相关药物的药效评价。(时间周期：2-3个月)附图说明附图1是TALEN/CRISPR基因敲除位点。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下，可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实验例1.1材料1.1.1实验动物野生型C57BL/6小鼠品系，购自北京维通利华有限公司，合格证号：SCXK(京)2014-0001。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房，实验动物使用许可证：SYXK(京)2017-0020，动物房温度20～26℃，相对湿度40～70％。1.1.2TALEN质粒TALEN质粒pCS5-eTALEN-T由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。靶位点位置1：TCAGAGCCCAGAGACGATgatgatgacaagcaggtgGTCGCAGAGATCATGGCA，其中左边TALE识别序列：CAGAGCCCAGAGACGAT17bp，右边TALE识别序列：GCCATGATCTCTGCGAC17bp，间隔18bp。靶位点位置2：TGGTCGCAGAGATCATGGcaagaagttttatccCAACTCTGATAACGACTA，其中左边TALE识别序列：GGTCGCAGAGATCATGG17bp，右边TALE识别序列：AGTCGTTATCAGAGTTG17bp，间隔：15bp，靶位点位置3：TTTGCTGGTCATGAGATTcagattactgaaggcAAAGATTGCTATGGTGCA其中左边TALE识别序列：TTGCTGGTCATGAGATT17bp右边TALE识别序列：GCACCATAGCAATCTTT17bp，间隔：15bp1.1.3引物设计基因型检测PCR引物：Mettl21e-CDS-F1：ATGGACCTCACAGTAACTCACAT23bp*Mettl21e-CDS-R1：GCTTGCCACAATGGAGACAAG21bp，Real-Time引物：Mettl21e-f：GGAAGGCTTTCACTTTGCTG，Mettl21e-r：TCCCAGCTCCAATTTCAATC，内参为18s-F：CATGCAGAACCCACGACAGTA，18s-R：CCTCACGCAGCTTGTTGTCTA。1.1.4试剂本实验的引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。AmpPCRmix(TAKARA，Ro74A)试剂盒、TransZolUpPlusRNAKit(Tran，ER501-01)、EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix(Tran，AE301-03)、TransStrtTopGreenqPCRSuperMix(Tran，AQ131-02)、Base(碱液)、Neutrlization(中和液)等。1.2方法1.2.1Mettl21e基因敲除首建鼠的构建针对每个基因，根据目标基因的基因组序列，设计TALEN靶点位置。TALEN靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，不在最后一个exon上，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。将构建好的TALEN/CRISPR质粒对，进行SSA活性检测。选择活性高的TALEN/CRISPR用于后续基因敲除小鼠构建。体外转录成mRNA后，共显微注射mRNA到小鼠的受精卵中，出生27只小鼠。两周龄后，剪取4周龄出生小鼠任一只耳朵大约三分之一，放置在做好标记的1.5ml的离心管中，加入75ul碱液(Base)95℃以上40分钟；然后加入75ul中和液(Neutrlization)，常温静置5分钟，溶液即为提取的基因组DNA。以此基因组DNA为模板进行PCR反应，将产物进行测序。通过测序图可分析小鼠的突变情况：如果测序峰全是单峰说明该小鼠是WT(野生型)；如果测序峰在预定位置出现双峰且2种峰恰好对应不同的突变类型则该小鼠为Mettl21e基因敲除首建鼠(Founder)。共有12只小鼠带有突变本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型Mettl21e基因敲除小鼠模型的创建在药效学评价方面的用途。
【技术特征摘要】
1.一种新型Mettl21e基因敲除小鼠模型的创建在药效学评价方面的用途。2.Mettl21e基因敲除...
【专利技术属性】
技术研发人员：金文，匡世焕，孙晓波，张彬，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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