一种检测靶向基因敲除效果的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测靶向基因敲除编辑效果的方法。其包括如下步骤：处理组：1)构建含有编码靶标蛋白的靶向基因的表达盒的过表达载体；2)构构建靶向基因的敲除编辑载体；3)将所述过表达载体和所述敲除编辑载体共同转入到待编辑的细胞中，得到待检测细胞群；4)通过检测所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量的变化来确定所述敲除编辑载体是否有效。

A Method for Detecting the Effect of Targeted Gene Knockout

The invention relates to a method for detecting the editing effect of targeted gene knockout. It includes the following steps: treatment group: 1) construction of over-expression vector containing target gene expression box encoding target protein; 2) construction of knockout editing vector of target gene; 3) transfer the Over-expression Vector and knockout editing vector into the cells to be edited to obtain the cell population to be detected; 4) detection of the target protein content in the cell population to be detected; The change determines whether the knockout editing carrier is valid.

【技术实现步骤摘要】
一种检测靶向基因敲除效果的方法
本专利技术涉及一种检测靶向基因敲除效果的方法。
技术介绍
CRISPR/Cas9(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPRassociated)系统由两部分组成：介导识别的gRNA(guideRNA)和负责切割的Cas9蛋白。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术应用研究非常广泛。作为一项强大的基因编辑技术，例如基因敲除技术，对构建的CRISPR/Cas9质粒进行敲除效果检测显得尤为重要。一般情况下，将CRISPR/Cas9质粒转入细胞后，若由于基因敲除致使细胞发生大量凋亡，则无法通过流式细胞筛选、单细胞培养或以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增的方式来验证是否产生了碱基的缺失或插入等基因敲除结果。对于基因敲除并不会引起细胞大量凋亡的多数情况下，经过CRISPR/Cas9基因编辑的细胞虽然在经过多次尝试后能够建立稳定的细胞系，但是如果得到的细胞系中存在由于CRISPR/Cas9不能特异性识别靶标片段，而导致没能进行有效的CRISPR/Cas9基因编辑，那么获得的细胞系也是没有任何价值的。于是，细胞建系的过程不仅费时、费力，也不利于研究工作的进行。
技术实现思路
基于现有技术中存在的问题，专利技术人也曾尝试通过其他常规手段来加以解决，然而并没有任何进展。例如，以常规的基因敲除处理组与基因未敲除的空白对照组的Westernblot定量比较来进行分析，然而终因难以达到显著性差异而无法判断靶标基因的可敲除性，甚至导致在很多情况下得出所使用的敲除载体不起作用的错误结论。在经过多种尝试和探索后，确定了本专利技术的技术方案：构建待敲除的靶向基因的过表达盒，并将该过表达盒同CRISPR/Cas9质粒共同导入细胞，然后通过Westernblot等方式来检测待敲除的靶向基因表达蛋白表达量的变化，以此来检测CRISPR/Cas9质粒对细胞中靶向基因的可编辑性。通过这一改进，一方面，对于靶向基因敲除不会引起细胞大量凋亡的多数情况下，省去了建立稳定细胞系后提取基因组的测序过程，因而耗时更少，操作方法更加简单易行。另一方面，对于靶向基因敲除引起细胞大量凋亡的情况，由于无法通过流式细胞筛选、单细胞培养或以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增等现有技术来验证基因编辑效果而显得束手无策。更重要的是，通过本专利技术的这一巧妙构思使原本通过蛋白定量分析无法检测的方法得以使用，化解了现有技术中存在的各种难题。此外，由于在该方法中可以在过表达盒中加入标签，因此，能够利用标签抗体来间接检测靶向基因表达蛋白表达量的多少进而再确定CRISPR/Cas9系统对靶基因的敲除效果，以达到检测的目的。因此，非常适合那些没有特异性抗体的待敲除的目的基因。与此同时，还可以为后期在活体进行显微注射等操作实验提供可靠的依据。具体来讲，本专利技术提供了一种检测靶向基因敲除效果的方法，其包括如下步骤：处理组：1)构建含有编码靶标蛋白的靶向基因的表达盒的过表达载体；2)构建靶向基因的敲除编辑载体；3)将所述过表达载体和所述敲除编辑载体共同转入到待编辑的细胞中，得到待检测细胞群；4)通过检测所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量的变化来确定所述敲除编辑载体是否有效。在一个具体实施方式中，所述方法中还包括过表达对照组：将所述过表达载体转入到所述细胞(即与待编辑的细胞相同的细胞)中，得到过表达细胞群；通过比较所述待检测细胞群中所述靶标蛋白与所述过表达细胞群中的所述靶标蛋白的量来确定所述敲除编辑是否有效。在一个具体实施方式中，当所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量少于所述过表达细胞群中的所述靶标蛋白的量时，所述敲除编辑有效。在一个具体实施方式中，当所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量与所述过表达细胞群中的所述靶标蛋白的量相当时，所述敲除编辑无效。经过大量实验发现，在转染后培养60至84小时蛋白的表达量比较大，在敲除有效的情况下，在这个时间段检测，能够非常好的区分出过表达对照组与处理组之间的靶标蛋白的量的差异。在一个具体实施方式中，在转入所述载体后，培养60至84小时后测得所述靶标蛋白的量。在一个具体实施方式中，在转入所述载体后，培养72小时后测得所述靶标蛋白的量。在一个具体实施方式中，所述靶标蛋白的量通过WesternBlot的方式来确定。在一个具体实施方式中，所述靶向基因的敲除编辑载体为CRISPR/Cas9系统。在一个具体实施方式中，所述细胞为昆虫细胞。在一个具体实施方式中，优选所述细胞为斜纹夜蛾细胞系Spli221、草地贪夜蛾细胞系Sf9、粉纹夜蛾细胞系HighFive中的一种。在一个具体实施方式中，所述CRISPR/Cas9系统为适于昆虫的CRISPR/Cas9系统；优选所述CRISPR/Cas9系统为A3EGFP和IE1Cas9。在一个具体实施方式中，所述过表达盒中的所述靶向基因与标签基因融合。如此可以通过标签抗体来检测靶向蛋白与标签的融合蛋白。在一个具体实施方式中，所述标签选自组氨酸标签、Tag标签、Flag标签、V5标签中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述过表达载体在空载时为pIZT/V5-His质粒。在一个具体实施方式中，所述方法中还包括空白对照组：所述细胞不做任何处理，得到未处理细胞群；和仅转入所述敲除编辑载体到待编辑的细胞中的第二待检测细胞群；比较所述第二待检测细胞群中所述靶标蛋白与所述未处理细胞群中的所述靶标蛋白的量。在一个具体实施方式中，当所述第二待检测细胞群中所述靶标蛋白的量与所述未处理细胞群中的所述靶标蛋白的量相当时；且当所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量少于所述过表达细胞群中的所述靶标蛋白的量时，所述敲除编辑有效。附图说明图1A为第一处理组与空白对照组中的ATPaseβ蛋白在表达72h后的WesternBlot结果。其中，A3EGFP-ATPaseβgRNA质粒与IE1Cas9质粒共同转染Spli221细胞为第一处理组，未转染A3EGFP-ATPaseβgRNA质粒与IE1Cas9质粒的Spli221细胞为空白对照组；ATPaseβ的大小约为53kDa；M为蛋白Marker；GAPDH是在细胞中稳定表达的蛋白质，作为内参。由图可知，第一处理组中的ATPaseβ蛋白表达水平与空白对照组中的ATPaseβ蛋白表达水平在可视水平上无差异。图1B为第一处理组和空白对照组中的ATPaseβ蛋白在表达72h后的的差异性分析结果。根据t检验的结果，NS表示在p<0.001水平上无显著性差异性。其中，ATPaseβ蛋白表达水平为三次独立重复试验的平均值。图2A为第二处理组与过表达对照组中的ATPaseβ蛋白在表达72h后的WesternBlot结果。其中，pIZT/V5-His-ATPaseβ过表达质粒、A3EGFP-ATPaseβgRNA质粒与IE1Cas9质粒共同转染Spli221细胞为第二处理组，pIZT/V5-His-ATPaseβ过表达质粒单独转染Spli221细胞为过表达对照组；ATPaseβ与V5标签融合蛋白大小约为58KDa；M为蛋白Marker；GAPDH是在细胞中稳定表达的蛋白质，作为内参。由图可知，第二处理组中的ATPaseβ蛋白表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测靶向基因敲除效果的方法，其包括如下步骤：处理组：1)构建含有编码靶标蛋白的靶向基因的表达盒的过表达载体；2)构建靶向基因的敲除编辑载体；3)将所述过表达载体和所述敲除编辑载体共同转入到待编辑的细胞中，得到待检测细胞群；4)通过检测所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量的变化来确定所述敲除编辑载体是否有效。

【技术特征摘要】
1.一种检测靶向基因敲除效果的方法，其包括如下步骤：处理组：1)构建含有编码靶标蛋白的靶向基因的表达盒的过表达载体；2)构建靶向基因的敲除编辑载体；3)将所述过表达载体和所述敲除编辑载体共同转入到待编辑的细胞中，得到待检测细胞群；4)通过检测所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量的变化来确定所述敲除编辑载体是否有效。2.根据权要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中还包括过表达对照组：将所述过表达载体转入到所述细胞中，得到过表达细胞群；通过比较所述目标细胞群中所述靶标蛋白与所述过表达细胞中的所述靶标蛋白的量来确定所述敲除编辑是否有效。3.根据权要求2所述的方法，其特征在于，当所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量少于所述过表达细胞群中的所述靶标蛋白的量时，所述敲除编辑有效；和/或当所述待检测细胞群中所述靶标蛋白的量与所述过表达细胞群中的所述靶标蛋白的量相当时，所述敲除编辑无效。4.根据权要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于，在转入载体后，培养60至84小时后测定所述靶标蛋白的量。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗开珺，何浩娟，寇田超，尤姗，陈昶旭，张雪雯，刘甜，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53