一种增强放线菌基因编辑效率的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种增强放线菌基因编辑效率的方法及其应用，是以删除天蓝色链霉菌中的actII‑ORF4为例，利用诱导型启动子tipAp、核糖体开关以及split Cas9控制Cas9活性，转化过程相比于传统的组成型Cas9表达，转化效率提高约260倍；编辑过程添加诱导物并提高ATP浓度，使编辑效率达到80％。本发明专利技术方法建立一个既能受到化学小分子诱导，又能受蓝光可逆调控的CRISPR/Cas9系统，从而保证在质粒转化效率和目的宿主正常生长代谢最大限度不受影响的情况下，实现基于双链断裂的精确高效基因编辑，本发明专利技术应用于包含链霉菌在内的其它模式或工业放线菌的基因工程和遗传修饰改造。

A Method for Enhancing the Efficiency of Gene Editing in Actinomycetes and Its Application

The present invention provides a method for enhancing the efficiency of gene editing of actinomycetes and its application. Taking the deletion of actII_ORF4 from Streptomyces ceruleus as an example, the activity of Cas9 is controlled by the inductive promoter tipAp, ribosome switch and split Cas9. Compared with the traditional constitutive Cas9 expression, the transformation efficiency is increased by about 260 times, and the concentration of ATP is increased by adding inducers in the editing process. The efficiency of editing is up to 80%. The method of the invention establishes a RISPR/Cas9 system, which can be induced by small chemical molecules and reversibly regulated by blue light, so as to ensure that the plasmid transformation efficiency and the normal growth and metabolism of the target host are not affected to the greatest extent, to achieve accurate and efficient gene editing based on double-strand breaking. The invention is applied to other modes or industrial actinomycetes including streptomyces. Gene engineering and genetic modification.

【技术实现步骤摘要】
一种增强放线菌基因编辑效率的方法及其应用
本专利技术属于基因工程和基因遗传修饰领域，明确地说，涉及在放线菌中通过控制Cas9活性及ATP浓度增强基因编辑效率的方法及应用。
技术介绍
CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是原核生物中特有的免疫系统，伴随有特异性序列的RNA介导，对外源DNA识别并降解，引起外源DNA功能缺使其失活。近几年，CRISPR/Cas9系统作为一种针对特异性位点的基因定向编辑技术，具有操作简易便捷、投入少、效率高、具有良好特异性和普适性等优势，近两年被认为是分子机制解剖和基因表达控制最强大的基因组编辑工具包，在哺乳动物蛋白质工程，治疗干预和药物发现的合成生物学的细胞重编程方面表现出巨大的潜力，并且还用于微生物代谢工程，巨型染色体构建甚至操纵遗传上棘手的微生物。CRISPR/Cas9系统可对目的基因精确编辑。将外源的DNA指引到宿主细胞染色体的特异性位点上，实现定位定向地基因编辑。该系统首先利用设计的引导RNA(single-guideRNA,sgRNA)介导Cas9蛋白与目的位点特异性结合，完成DNA的特异性切割，并通过同源重组或非同源末端连接的方式自我修复，从而实现基因的敲除、敲入等。然而，CRISPR/Cas9系统的脱靶效应和毒性活性会极大程度地妨碍其应用。Cas9毒性在微生物操作中的可见后果是转化体的急剧减少，例如在优秀的基因工程宿主大肠杆菌、酵母和链霉菌中，最常导致遗传修饰失败。其中链霉菌在临床使用药物生产中具有特殊工业价值。因此，如何在提高CRISPR/Cas技术基因编辑效率的同时提高其靶向性，是该技术目前面临的一大难题。目前研究表明，链霉菌中发现一种硫链丝菌素诱导型启动子tipAp，可用于CRISPR/Cas9编辑系统中抑制Cas过表达的调控元件。并可以通过人为添加硫链丝菌素，诱导tipAp启动子开放转录，在编辑过程中实现Cas9活性重建，达到在转录水平控制Cas9活性的目的。另一方面相关研究报导，长度达85bp的茶碱依赖性核糖体开关，在非诱导条件下转录出的非编码RNA存在高级结构，可以阻止下游编码基因表达的mRNA与核糖体结合，抑制多肽链合成使蛋白表达处于极低水平，可用于转化效率的控制。但是在茶碱诱导下可以解开高级结构，因此加入茶碱后可产生数百倍的诱导表达，这种遗传工具可实现在翻译水平上控制Cas9活性。此外，目前已有研究开发了一种在人类细胞中实现Cas9活性控制的蓝光诱导型Cas9蛋白重建技术。真菌光受体Vivid被设计分成两种蛋白质，即正极蛋白(pMag)和负极蛋白High1(nMagHigh1)，这两种蛋白在蓝光诱导条件下异质二聚化，重建Cas9结构与活性。这种光可切换的优势已被用于开发可光活化的裂解Cas9(N713-pMag和nMagHigh1-C714)，实现在蛋白质水平精确控制Cas9活性和基因编辑。此外，由Cas9引起的双链断裂需通过同源定向重组(HDR)进行精确修复，该同源定向重组(HDR)由ATP依赖性DNA修复系统施加，包括真核细胞中的Rad51/Rad52和大肠杆菌中的RecA触发的SOS途径。其中RecA是一种ATP依赖性重组酶，在DSB后在单链DNA上形成细丝，随后促进同源搜索和交换以进行同源重组，从而保证基因组的完整性和稳定性。而ATP在HDR期间起着重要作用，因为ATP与DNA上的Rad51/RecA细丝相关，并且ATP的水解至少在RecA-ssDNA，RecA沿DNA滑动的之间动态相互作用、防止长重复序列之间的配对以及Rad51细丝拆解过程中的构象变化等方面起重要作用。因此在编辑过程中提升ATP浓度利于同源定向重组(HDR)，进一步提升基因编辑效率。出于上述考虑和背景研究，本专利技术公开了一种在放线菌中通过控制Cas9活性及ATP浓度增强基因编辑效率的方法及其应用。该方法明确，高效，易操作，提供了一种有效提高微生物宿主中目的基因编辑效率的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种增强放线菌基因编辑效率的方法及其应用，是一种在放线菌中通过控制Cas9活性及ATP浓度增强基因编辑效率的方法，针对的是为目的基因编辑效率的提高，提供一种新型的CRISPR/Cas9系统。这是一种基于添加控制Cas9活性及ATP浓度的元件，高效调控转化效率和编辑效率的新技术。本专利技术方法具体通过如下步骤实现：(1)根据目的宿主生理特性挑选合适的诱导型启动子、强启动子和骨架质粒；(2)将步骤(1)筛选的诱导型启动子、核糖体开关、splitCas9以及强启动子-atpD高供能基因盒插入到步骤(1)所选骨架质粒中；(3)设计目的编辑位点的间隔序列(左臂加右臂)，分别插入步骤(2)所构质粒，用于引导Cas9蛋白向靶序列移动；(4)根据宿主生理性质和质粒元件，选取合适的筛选转化子的抗生素或营养缺陷型等筛选方式，也在步骤(3)构建的质粒中另外添加表达抗生素和营养缺陷型等的相关基因；(5)在非诱导条件下，将步骤(4)中的重组质粒转化(或接合转导等适合于目的宿主的遗传操作)进入目的宿主中，通过添加筛选条件的培养基筛选，筛选得到携带重组质粒的转化子；(6)将步骤(5)中的转化子接种带有合适筛选条件的富集培养基，恒温发酵；(7)取步骤(6)中发酵24h–48h的发酵液，离心收取菌体，用无菌水清洗两次，离心弃上清，更换添加合适浓度启动子诱导条件和茶碱的培养基，随后在蓝光诱导条件下摇床恒温培养；(8)取(7)中发酵液离心，弃上清，收集的沉淀就是完成目的基因编辑的菌株。本专利技术的目的是提供所述方法在有效提高目的宿主基因编辑效率中的应用。1.本专利技术方法是通过筛选合适的诱导型启动子(如硫链丝菌素诱导型启动子tipAp)实现在转化过程中抑制Csa9蛋白过表达，后续添加启动子诱导条件(如硫链丝菌素)诱导重建Cas9活性，实现在转录水平精准控制Cas9活性。2.本专利技术方法是通过茶碱依赖性核糖体开关在转化过程中抑制Cas9蛋白多肽链的合成，后续添加茶碱诱导核糖体开关开启多肽链的合成，实现在翻译水平精准控制Cas9活性。3.本专利技术方法是通过蓝光诱导型分裂Cas9蛋白在转化过程中分裂成两个蛋白而导致功能缺失，后续添加蓝光诱导两种蛋白异质二聚化，重建Cas9结构与活性，实现在蛋白质水平精准控制Cas9活性。4.本专利技术方法是通过编码ATP合酶的β-亚基的atpD基因在强组成型启动子(如ermEp*)下表达，提供ATP利于同源定向重组(HDR)，提高编辑效率。5.本专利技术提出一种在放线菌中通过控制Cas9活性及ATP浓度增强基因编辑效率的新型CRISPR/Cas9系统，该系统添加合适的诱导型启动子(如硫链丝菌素诱导型启动子tipAp)、核糖体开关、以及splitCas9实现对Cas9活性的三重控制，最大限度抑制未诱导时CRISPR/Cas9系统的细胞毒性与脱靶概率；构建的ATP合酶的β-亚基的atpD基因保证ATP的有效供给，进一步提高目的宿主中的基因编辑效率，本专利技术可适用于包含链霉菌在内的其他模式或工业放线菌的基因工程和高效遗传改造。与现有技术相比，本专利技术的增益效果和明显优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强放线菌基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：(1)根据目的宿主生理特性挑选合适的诱导型启动子、强启动子和骨架质粒；(2)将步骤(1)筛选的诱导型启动子、核糖体开关、split Cas9以及强启动子‑atpD高供能基因盒插入到步骤(1)所选骨架质粒中；(3)设计目的编辑位点的间隔序列(左臂加右臂)，分别插入步骤(2)所构质粒，用于引导Cas9蛋白向靶序列移动；(4)根据宿主生理性质和质粒元件，选取合适的筛选转化子的抗生素或营养缺陷型等筛选方式，也在步骤(3)构建的质粒中另外添加表达抗生素和营养缺陷型等的相关基因；(5)在非诱导条件下，将步骤(4)中的重组质粒转化进入目的宿主中，通过添加筛选条件的培养基筛选，筛选得到携带重组质粒的转化子；(6)将步骤(5)中的转化子接种带有合适筛选条件的富集培养基，恒温发酵；(7)取步骤(6)中发酵24h–48h的发酵液，离心收取菌体，用无菌水清洗两次，离心弃上清，更换添加合适浓度启动子诱导条件和茶碱的培养基，随后在蓝光诱导条件下摇床恒温培养；(8)取(7)中发酵液离心，弃上清，收集的沉淀就是完成目的基因编辑的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种增强放线菌基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：(1)根据目的宿主生理特性挑选合适的诱导型启动子、强启动子和骨架质粒；(2)将步骤(1)筛选的诱导型启动子、核糖体开关、splitCas9以及强启动子-atpD高供能基因盒插入到步骤(1)所选骨架质粒中；(3)设计目的编辑位点的间隔序列(左臂加右臂)，分别插入步骤(2)所构质粒，用于引导Cas9蛋白向靶序列移动；(4)根据宿主生理性质和质粒元件，选取合适的筛选转化子的抗生素或营养缺陷型等筛选方式，也在步骤(3)构建的质粒中另外添加表达抗生素和营养缺陷型等的相关基因；(5)在非诱导条件下，将步骤(4)中的重组质粒转化进入目的宿主中，通过添加筛选条件的培养基筛选，筛选得到携带重组质粒的转化子；(6)将步骤(5)中的转化子接种带有合适筛选条件的富集培养基，恒温发酵；(7)取步骤(6)中发酵24h–48h的发酵液，离心收取菌体，用无菌水清洗两次，离心弃上清，更换添加合适浓度启动子诱导条件和茶碱的培养基，随后在蓝光诱导条件下摇床恒温培养；(8)取(7)中发酵液离心，弃上清，收集的沉淀就是完成目的基因编辑的菌株。2.根据权利要求1所述的一种增强放线菌基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛旭明，李永泉，刘一帆，王凯，罗帅，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33