一种利用CRISPR/Cas9系统构建敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法技术方案

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法。本发明专利技术包括以下步骤：1)设计高效识别敲除后致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性鼠；3)利用阳性首建鼠分析致死基因在组织器官中的功能。本发明专利技术的技术方案与基于Cre/loxP系统的组织特异性敲除的现有技术相比，制作周期短，周期仅为3个月左右。

A Method of Constructing Knockout Mice Model with CRISPR/Cas9 System to Analyse the Function of Lethal Gene

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for constructing a gene knockout mouse model to analyze the function of lethal genes by using CRISPR/Cas9 system. The invention comprises the following steps: 1) designing a sgRNA sequence for efficiently identifying the PAM region of the knockout lethal gene; 2) mixing Cas9's mRNA or protein with the sgRNA designed in step 1, microinjecting the mixture into any blastomere cell of a mouse two-cell embryo, embryo transfer after injection, strain gene identification, and obtaining chimeric positive mice with knockout lethal; 3) utilizing positive mice; It was the first mouse to analyze the function of lethal genes in tissues and organs. Compared with the existing technology of tissue specific knockout based on Cre/loxP system, the technical scheme of the invention has a shorter production cycle and a period of only about 3 months.

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9系统构建敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种利用CRISPR/Cas9系统构建敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法。
技术介绍
敲除后致死基因因为在机体内发挥重要作用从而受到特别关注。研究预测致死基因约占小鼠基因的23％(Cell,2013,154:452；Nature2016,537:508)。敲除后致死基因是指基因功能的全身性缺失导致个体在胚胎期和出生后死亡的一类基因，包括胚胎期致死基因和出生后致死基因，因此无法通过全身性敲除小鼠模型研究致死基因在成年机体内的功能。条件性基因敲除可以避免致死基因敲除动物成年期死亡，即在特定的组织细胞或细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因，从而研究特定基因在特定组织内(及特定的时间)的功能。基于Cre/Loxp重组系统的条件性基因敲除小鼠模型是研究致死基因成年机体内功能的现有常用方法(Science,1995,269：1427)，大体包括以下以下4个步骤：(1)在目的致死基因敲除的外显子两侧各插入一个loxp位点，得到floxed(flankedbyloxp)小鼠；(2)构建组织性特异表达的Cre转基因鼠模型；(3)floxed鼠与组织特异性表达的Cre鼠交配2代以上，获得致死基因组织性特异敲除的成年小鼠；(4)致死基因组织性特异敲除鼠扩繁成群，用于成年机体内的基因功能研究。但是，此方法制作步骤繁琐，并且制作周期长，周期为2年以上。并且，此方法无法快速实现致死基因不用组织中功能的筛选。因为研究致死基因在成年期不同组织的功能时，需要不同的Cre小鼠与floxed鼠配种扩繁，操作繁琐，资源占用量大，不利于研究开展。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种利用CRISPR/Cas9系统构建敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法，此方法适用于分析胚胎期致死性基因和出生后致死性基因的体内功能。通过该方法可以简单、快速、高效地分析致死基因的体内功能。本专利技术的具体技术方案如下：本专利技术的利用CRISPR/Cas9系统构建敲除小鼠模型基因敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法，包括以下步骤：1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性鼠；3)利用基因敲除的嵌合阳性鼠分析致死基因在各个组织器官中的功能。本专利技术所述的方法，可以针对任意种类的致死基因，包括但不限于Actr6，Armc7，Armh3，Arpc3，Atad3a，Atp5e，Atp5f1，Atxn10，Cenpl，Chka，Chmp6，Copg1，Cpsf3，Crls1，Ctla-4，Ctr9，Dars2，Dctn1，Dctn4，Ddx55，Dhodh，Dhps，Dhx33，Dpm1，Dync1i2，Dynlrb1，Ears2，Elac2，Exoc3，Exosc9，Fdft1，Fignl1，Gbf1，Gtf2h2，Ints11，Ints2，Kif18b，L3mbtl2，Lars，Leo1，Lsm10，Mau2，Med19，Mrps21，Mrps5，Mtor，Nat10，Ndufb8，Nelfe，Nhlrc2，Nhp2，Npat，Nup85，Ogdh，Orc1，Pam16，Pdcd2，Pgap2，Pitrm1，Pold3，Polr2f，Polr3f，Polr3g，Rbm33，Rnasek，Rpia，Sap130，Setd1a，Sfpq，Slc17a5，Slu7，Smc3，Smg1，Srsf7，Supt5，Taf11，Tet3，Timeless，Tmem30a，Trub2，Usp37，Usp5，Virma，Vps33b，Wac等中的一种或几种，进一步优选地，所述致死基因为Slc17a5和/或Virma。根据本专利技术所述的方法，作为优选地，所述致死基因为Slc17a5，sgRNA序列如SEQIDNO.1所示。或者，所述致死基因为Virma，sgRNA序列如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术的方法，其中，步骤3)所述利用基因敲除的嵌合阳性鼠分析致死基因在组织器官中的功能，可以是使用各种本领域公知的方法利用本专利技术基因敲除的嵌合阳性鼠分析致死基因在任意组织器官中的功能。例如但不限于为，分析致死基因与颌下腺组织的分泌功能的关系，或者，分析致死基因与肾脏组织的代谢功能的关系。具体地，可以是分析Slc17a5基因与调控颌下腺组织内硝酸盐与唾液酸的分泌功能的关系，或者，分析Virma基因与肾脏组织的代谢功能的关系等等。针对现有技术不能得到致死性基因全身性敲除的成年期纯合子小鼠模型，从而无法分析致死基因在成年期小鼠体内功能的问题。本专利技术运用CRISPR/Cas9系统通过二细胞胚胎注射的方式成功构建致死性基因敲除的嵌合首建鼠(包括胚胎致死性基因和出生后致死基因)，并将嵌合首建鼠应用于致死基因成年期体内功能的分析，从而证明二细胞胚胎注射的方式构建致死性基因敲除嵌合小鼠模型的创新性和可行性。基于Cre/Loxp重组系统的条件性基因敲除小鼠模型是研究致死基因成年机体内功能的现有常用方法，此方法制作步骤繁琐，技术操作难度高，并且制作周期长，周期为2年以上。本专利技术的二细胞胚胎注射的方法操作步骤简单，操作难度低，并且制作周期短，周期为3个月左右。本专利技术可以完全替代Cre/Loxp重组系统的条件性基因敲除小鼠模型分析致死基因成年期体内功能，提高工作效率，降低生产成本。并且，本专利技术的方法适用于各类品系小鼠致死基因敲除模型的构建以及分析致死基因功能。附图说明图1为本专利技术实施例1中基因敲除首建鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果；图2为本专利技术实施例1中基因敲除首建鼠的基因型鉴定突变位点片段TA克隆结果；图3为本专利技术实施例1中小鼠颌下腺组织内Slc17a5基因表达倍数比较结果，其中，＊＊P＜0.01；图4为本专利技术实施例1中小鼠的唾液和血清中硝酸盐浓度比较结果，其中，＊＊P＜0.01；图5为本专利技术实施例1中小鼠的唾液中唾液酸盐浓度比较结果，其中，＊P＜0.05；图6为本专利技术本专利技术实施例2中首建鼠的基因型鉴定突变位点片段Sanger测序结果；图7为本专利技术实施例2中小鼠肾脏组织内Virma基因表达倍数比较结果，其中，＊P＜0.05；图8为本专利技术实施例2中小鼠肾脏组织HE染色结果；图9为本专利技术实施例2中小鼠肾小球直径比较结果，其中，＊＊P＜0.01；图10为本专利技术实施例2中小鼠的肺、肝脏、颌下腺、脑、脾、心脏及胸腺组织的HE染色结果。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。本专利技术的利用CRISPR/Cas9系统构建致死基因全身性敲除小鼠模型的方法，具体构建过程如下：1、CRSIPR/Cas9系统原件的构建：NCBI网站搜索致死本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法，包括以下步骤：1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性鼠；3)利用基因敲除的嵌合阳性鼠分析致死基因在组织器官中的功能。

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除小鼠模型分析致死基因功能的方法，包括以下步骤：1)设计高效识别致死基因PAM区域的sgRNA序列；2)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤1)设计的sgRNA混合，将混合物对小鼠二细胞胚胎中的任意一个卵裂球细胞显微注射，注射后胚胎移植，品系基因鉴定，得到致死基因敲除的嵌合体阳性鼠；3)利用基因敲除的嵌合阳性鼠分析致死基因在组织器官中的功能。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致死基因为Actr6，Armc7，Armh3，Arpc3，Atad3a，Atp5e，Atp5f1，Atxn10，Cenpl，Chka，Chmp6，Copg1，Cpsf3，Crls1，Ctla-4，Ctr9，Dars2，Dctn1，Dctn4，Ddx55，Dhodh，Dhps，Dhx33，Dpm1，Dync1i2，Dynlrb1，Ears2，Elac2，Exoc3，Exosc9，Fdft1，Fignl1，Gbf1，Gtf2h2，Ints11，Ints2，Kif18b，L3mbtl2，Lars，Leo1，Lsm10，Mau2，Med19，Mrps21，Mrps5，Mtor，Nat10，Ndufb8，Nelfe，Nhlrc2，Nhp2，Npat，Nup85，Ogdh，Orc1，Pam16，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈柏安，仵毅，王松灵，张婧，陈雨心，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11