一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用。所述核酸适配体其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术的核酸适配体可用于食品中的检测芳香族生物胺酪胺，达到快速、准确的目的，该核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。

A Nucleic Acid Adapter Specifically Recognizing Tyramine and Its Application

The invention discloses a nucleic acid adapter specifically recognizing tyramine and its application. The nucleotide sequence of the nucleic acid adapter is shown as SEQ ID No.1. The nucleic acid adapter of the present invention can be used for the detection of aromatic biogenic aminotyramine in food to achieve rapid and accurate purposes. The nucleic acid adapter has good affinity and specificity and can be synthesized artificially. Therefore, it has low cost, short production cycle, good repeatability between batches, high stability, long-term preservation and chemical modification.

【技术实现步骤摘要】
一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用
本专利技术属于食品安全生物
，具体涉及一种特异识别酪胺的核酸适配体及其应用。
技术介绍
生物胺(Biogenicamines，BA)是一类具有生物活性、含氮的碱性低分子量有机化合物，普遍存在于多种动植物体内及发酵食品中，主要是通过氨基酸脱羧作用或是醛和酮的胺化和转氨基作用形成的。根据生物胺的化学结构，可将其可以分为三类：脂肪族生物胺(尸胺、腐胺、精胺、亚精胺等)；芳香族生物胺(酪胺、β-苯乙胺等)；杂环族生物胺（组胺、色胺等）。生物胺在多种动植物和微生物体内为正常的活性成分，是合成激素、生物碱和核酸的前体物质，维持着免疫系统的代谢活动和内脏功能。然而，高浓度的生物胺不仅会严重影响食品的口感风味甚至会改变其物质成分，过量外源生物胺的摄入还会对人体产生毒害作用，引起血管和动脉的扩张，致使生物体产生不良反应，如头疼、高血压、腹泻和呕吐等，同时生物胺的协同效应还可以增加中毒症状。生物胺含量还是一些食品新鲜程度和被微生物污染程度的标志，是预测某些食品成熟程度和加工过程是否遵循“良好操作规范”的依据，因此近年来各种食品中生物胺的合成机理、影响因素以及检测手段的改进倍受关注和重视，一些国家对食品中个别生物胺含量还法定了限量标准。适配体是能特异性识别某种靶标物质且具有高度亲和力的核酸序列（DNA或RNA），通常含有40-100个碱基，与抗体等检测元件相比，不仅容易合成和修饰，靶标分子范围广，涵盖了包括蛋白质、核酸以及其它无机、有机等分子，而且热稳定性好、维持活性的pH值和盐浓度范围广、变性和复性可逆。由于适配体的这些优点，它被广泛应用于疾病诊断和治疗、食品安全检测、分离提取等方面。适配体筛选的技术被称为配体指数富集系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)。自1990年，Gold研究组和Szostak研究组开创这一技术以来，针对不同类型的靶标已开发出了多种SELEX技术。而当涉及到小分子靶标时，通常意味着需要对它们进行化学修饰，然后将其固定在基质上，如磁珠或琼脂糖珠。但是这种化学修饰可能改变靶标的固有结构，导致筛选的适配体亲和力降低。此外，没有足够的位点固定小分子量的靶标。因此，出现了一些不进行靶标固定的筛选技术，包括Capture-SELEX，GO-SELEX，和切换SELEX。目前，关于生物胺的检测方法，国内外已经做了相当多的研究，成熟的检测方法主要包含有：液相色谱-质谱联用法(LC-MS或LC-MS/MS)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、气相色谱法(GC)、离子色谱法（IC）、毛细管电泳法(CE)、酶联免疫法、生物传感器、薄层色谱法(TLC)等。其中气相色谱、液相色谱、质谱、原子吸收方法的灵敏度较高，但是它们对样品前处理的要求很严格，复杂且消耗时间长，不适合现场操作。ELISA技术对目标物表现出很强的特异性，但是假阴性和假阳性结果偏多，样品提取液中的杂质成分对结果干扰大、制备抗体时间长、成本高。毛细管电泳法容易引起溶质的吸附，尤其是对一些生物大分子，并且这种吸附是不可逆的，造成基线不稳，重复性差。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种特异识别酪胺的单链DNA核酸适配体及其应用，为开发针对酪胺的新型分析检测和分离富集脱除净化方法奠定良好基础。一种特异识别酪胺的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步地，可用修饰材料对上述核酸适配体进行修饰，所述修饰材料为FAM、巯基基团、FITC或生物素。上述核酸适配体在制备食品中分离富集酪胺试剂中的应用。上述核酸适配体在制备食品中酪胺检测试剂中的应用。本专利技术方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以酪胺为靶标，筛选获得一条与靶标高亲和性、高特异结合的适配体TYR-2，可以通过荧光基团标记方法将获得的适配体转为检测探针，用于食品中的检测芳香族生物胺酪胺，达到快速、准确的目的。核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，因而成本低、生产周期短、不同批次间的重复性较好，其稳定性也较高，可长期保存，也便于化学修饰。附图说明图1为本专利技术筛选分离核酸适配体的流程图。图2为实施例1中得到的熔解曲线，R2-R18分别代表Capture-SELEX筛选过程中的循环轮数。图3为实施例1中Mfold预测适配体TYR-2的二级结构。图4为实施例1中适配体TYR-2的饱和结合曲线。图5为实施例1中适配体TYR-1、TYR-2、TYR-9的特异性分析结果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。本专利技术首先将随机ssDNA文库通过互补杂交固定在亲和素包被的磁珠表面。然后，在SELEX的分离步骤中有效分离了与靶标结合的ssDNA。通过针对酪胺十八轮筛选后，对获得的ssDNA富集文库进行克隆测序，并采用荧光法分析代表序列的亲和力和特异性。最终，获得了对酪胺具有高亲和力和特异性的核酸适配体。具体过程如图1所示。实施例11、随机ssDNA文库互补杂交和固定第一轮筛选反应体系为1mL，将随机ssDNA文库和生物素化的文库互补短链P1按照1：1.5的摩尔比加入到BB缓冲液（50mMTris-HCl，5mMKCl，100mMNaCl，1mMMgCl2，pH7.4)中，混匀后于95℃变性处理10min后，于37℃、130rpm条件下振荡孵育3h互补杂交。随后向其中加入一定量的1mg/mL亲和素包被的磁珠溶液在37℃、130rpm下反应6h，通过亲和素-生物素的特异性作用，使ssDNA文库固定在磁珠上。ssDNA固定化的磁珠采用BB缓冲液清洗10次以上，以去除非特异性结合的ssDNA，2、靶标与随机ssDNA文库的孵育与分离ssDNA固定化的磁珠溶液与靶标（酪胺，初始浓度为0.1mmol/L）在37℃下孵育2h，与靶标特异性结合的ssDNA从磁珠上解离下来，形成ssDNA-靶标复合物。在外加磁场作用下，得到能与靶标结合的ssDNA文库，以此作为模板进行PCR扩增。3、PCR扩增、纯化及ssDNA单链制备50μLPCR扩增反应体系为：超纯水41.5μL，10×PCRbuffer5μL，dNTP(5nmol/L)1μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL，下游磷酸化引物(10μmol/L)0.5μL，模板1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，PCR循环数为大约20次（每一轮筛选中对PCR循环次数进行优化），然后72℃延伸5min，最后4℃冷却。PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳及Bio-Rad凝胶成像仪检测扩增结果后，用PCR产物纯化试剂盒纯化。用NanoDrop-2000超微量分光光度计测定纯化的PCR产物的核酸浓度。然后加入一定量的Lambda核酸外切酶于37℃反应30-60min，75℃灭酶10min，以消化5′端磷酸基团修饰的DNA链，制备ssDNA。酶切产物采用含7M尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证酶切完全后，用酚/氯仿法进行纯化。将纯化后得到的ssDNA单链溶于40μLTE缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种特异识别酪胺的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异识别酪胺的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于：可用修饰材料对所述核酸适配体进行修饰，所述修...

【专利技术属性】
技术研发人员：段诺，糜唯钰，吴世嘉，王周平，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32