提高坛紫菜多糖生物活性的方法技术

本发明专利技术提出了一种提高坛紫菜多糖生物活性的方法，将坛紫菜粗多糖溶解于pH为3.5～6.0的缓冲液中，加入水解酶，使多糖终浓度为2～10mg/mL，水解酶终浓度为20～60U/mL，之后进行酶解反应，获得降解液；将降解液进行水浴处理使酶失活，离心，得上清液Ⅰ；将上清液Ⅰ进行透析，将所得透析液旋蒸浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥，得到坛紫菜降解多糖。本发明专利技术得到的坛紫菜降解多糖与坛紫菜粗多糖相比，体外抗氧化活性、胆酸结合活性和免疫活性均显著提高。本发明专利技术还提出一种如上述方法制备所得到的降解坛紫菜多糖作为功能性食品基料的应用。

Methods for Improving the Biological Activity of Porphyra haitanensis Polysaccharide

The invention provides a method for improving the biological activity of Porphyra haitanensis polysaccharide. The crude polysaccharide of Porphyra haitanensis is dissolved in a buffer solution with pH 3.5-6.0, and hydrolase is added to make the final concentration of the polysaccharide 2-10 mg/mL and the final concentration of the hydrolase 20-60 U/mL. Then the hydrolysate is enzymatically hydrolyzed and the hydrolysate is obtained; the hydrolysate is treated by water bath to inactivate the enzyme, centrifuge and obtain the supernatant I; I. After dialysis, the dialysate was concentrated to 20-30% of its original volume by rotary evaporation, and then freeze-dried to obtain the degraded polysaccharides from Porphyra haitanensis. Compared with the crude polysaccharides of Porphyra haitanensis, the degradable polysaccharides of Porphyra haitanensis obtained by the invention have significantly improved antioxidant activity, cholic acid binding activity and immune activity in vitro. The invention also provides an application of degraded Porphyra haitanensis polysaccharide as functional food base material prepared by the above method.

【技术实现步骤摘要】
提高坛紫菜多糖生物活性的方法
本专利技术属于化学化工
，涉及一种通过酶解坛紫菜粗多糖使其生物活性得到增强的方法。
技术介绍
坛紫菜属红藻纲，红毛菜科，俗称紫菜、乌菜，主要在我国福建、浙江等南部沿海地区多有种植，富含蛋白质、多糖和维生素，是一种食用与药用价值很高的海藻植物，所以很受人们的欢迎。紫菜味美价廉，资源丰富，综合这些特性，紫菜成为了一个研究热点，因此将坛紫菜开发成功能食品有很好的前景。坛紫菜多糖是一种半乳聚糖硫酸酯，占紫菜干重的30％左右，不同种类、不同季节和不同生长地区提取出的紫菜多糖的化学组分不同。坛紫菜粗多糖的分子量较大，生物活性较低。对多糖进行化学修饰和将其水解为分子量较小的组分都可使多糖的生物活性得到提高，但化学修饰可能会带来安全性问题。水解的方法虽然较多，其中酶法降解的优点是作用条件温和，且可避免硫酸基的脱落，缺点是不易得到水解效率高的酶。目前对坛紫菜多糖的酶法降解尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种提高坛紫菜多糖生物活性的方法；为解决上述技术问题，本专利技术提出一种提高坛紫菜多糖生物活性的方法，包括以下步骤：将坛紫菜粗多糖(CPH)溶解于pH为3.5～6.0的缓冲液中，加入水解酶，使多糖终浓度为2～10mg/mL，水解酶终浓度为20～60U/mL，之后进行酶解反应，获得降解液；所述酶解反应的条件为：pH3.5～6.0，反应温度为30～70℃，反应时间为0.5～4h。将降解液进行水浴处理(90±5℃，15±2min)使酶失活，离心，得上清液Ⅰ。将上清液Ⅰ进行透析(截留分子量为3500Da的透析袋透析72h)，将所得透析液(留在透析袋内的液体)旋蒸(60～65℃)浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥(-50～-60℃，24±1h)，得到坛紫菜降解多糖(DCPH)。作为本专利技术提高坛紫菜多糖生物活性的方法的改进：所述多糖终浓度为4mg/mL，水解酶终浓度为50U/mL；所述酶解反应的条件为：pH5.0，反应温度为47.5℃，反应时间为2h。作为本专利技术提高坛紫菜多糖生物活性的方法的进一步改进：所述水解酶为果胶酶；所述缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。作为本专利技术提高坛紫菜多糖生物活性的方法的进一步改进：将所得坛紫菜降解多糖(DCPH)进行分离纯化，包括以下步骤：①、粗分：向坛紫菜降解多糖(DCPH)中加入去离子水，配制获得浓度为35～45mg/mL的坛紫菜降解多糖(DCPH)溶液，离心(8000rpm的转速下离心10分钟)，取上清液Ⅱ，将上清液Ⅱ均匀(2min时间内滴加完毕)的滴入DEAECellulose-52层析柱中，依次用去离子水、浓度为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L的NaCl溶液进行洗脱，流速为1mL/min(当检测到洗脱剂对应的洗脱液中不含有多糖时，则换下一种洗脱剂进行洗脱；可采用硫酸-苯酚法隔管检测其在490nm处的紫外吸收值从而判断是否含有多糖)；分别收集并合并浓度为0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L的NaCl溶液洗脱出的3种含多糖的洗脱液，分别旋蒸浓缩(60℃下浓缩至约为原体积的8～12％)，透析(用截留分子量为3500Da的透析袋透析72h)除盐，将所得透析液冷冻干燥(-50～-60℃浓缩干燥至恒重)，得到坛紫菜酶解多糖的三个分离组分。注：采用DEAECellulose-52柱层析进行初步分离纯化，柱子规格为60cm×Φ2.6cm，有效长度为50cm。②、纯化：将步骤①所得3种分离组分分别进行以下操作：按照45～55mg：1mL的比例，将分离组分溶于去离子水中，离心(8000rpm的转速下离心10分钟)，取上清液Ⅲ，加于SephadexG-100凝胶柱的凝胶表面上，用去离子水进行洗脱，流速为0.25mL/min，自动收集器收集并合并含多糖的洗脱液，旋转蒸发浓缩(60℃的温度下浓缩至为原体积的8～12％)，冷冻干燥(-50～-60℃浓缩干燥至恒重)，获得对应分离组分的纯化多糖，即，P1、P2、P3。注：采用SephadexG-100凝胶色谱柱，层析柱规格为60cm×Φ1.6cm，柱子的有效体积为50cm×Φ1.6cm；作为本专利技术提高坛紫菜多糖生物活性的方法的进一步改进：所述坛紫菜多糖生物活性包括抗氧化活性、胆酸结合活性及免疫调节活性。为解决上述技术问题，本专利技术还提出一种如上述方法制备所得到的坛紫菜降解多糖、纯化多糖作为功能性食品基料的应用。备注说明：本专利技术坛紫菜粗多糖按文献文献报道方法制备(JieXu,Li-LiXu,Qin-WeiZhou,Shu-XianHao,TaoZhou,Hu-JunXie.EnhancedinvitroantioxidantactivityofpolysaccharidesfromEnteromorphaProliferabyenzymaticdegradation.JournalofFoodBiochemistry.doi:10.1111/jfbc.12218)。本专利技术具有如下技术效果：1.与坛紫菜粗多糖(CPH)相比，本专利技术得到的坛紫菜降解多糖(DCPH)的体外抗氧化活性、胆酸结合活性和免疫活性都得到显著提高。降解过程中对表现生物活性很重要的硫酸根基本没有受到影响。2.与DCPH相比，本专利技术得到的分离纯化多糖(P1、P2、P3)的体外抗氧化活性更强，对RAW264.7巨噬细胞的增值、吞噬、NO释放能力均显著提高，表明免疫活性增强。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是由本专利技术实施例1-1得到的降解多糖(DCPH)与粗多糖(CPH)的羟自由基清除能力的测定结果。图2是由本专利技术实施例1-1得到的降解多糖(DCPH)与粗多糖(CPH)的还原力的测定结果。图3是由本专利技术实施例1-1得到的降解多糖(DCPH)与粗多糖(CPH)的胆汁酸结合能力的测定结果。图4是由本专利技术实施例2-1的分离纯化多糖(P1、P2、P3)的DPPH自由基清除能力的测定结果。图5是由本专利技术实施例2-1的分离纯化多糖(P1、P2、P3)的羟自由基清除能力的测定结果。图6是由本专利技术实施例2-1的分离纯化多糖(P1、P2、P3)还原力的测定结果。图7是由本专利技术实施例1-1得到的降解多糖DCPH与实施例2-1得到的P1、P2与P3对RAW264.7巨噬细胞增殖能力的影响(图7上表示培养24h后的测试结果，图7下表示培养48h后的测试结果)。图8是由本专利技术实施例1-1得到的降解多糖DCPH与实施例2-1得到的P1、P2与P3对RAW264.7巨噬细胞吞噬能力的影响(图8上表示培养24h后的测试结果，图8下表示培养48h后的测试结果)。图9是由本专利技术实施例1-1得到的降解多糖DCPH与实施例2-1得到的P1、P2与P3对RAW264.7巨噬细胞释放NO的能力的影响(图9上表示培养24h后的测试结果，图9下表示培养48h后的测试结果)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1-1：提高坛紫菜多糖生物活性的方法，包括以下步骤：将坛紫菜粗多糖溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.0)中，加入果胶酶(3万U/g)，使所得的体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.提高坛紫菜多糖生物活性的方法，其特征是包括以下步骤：将坛紫菜粗多糖溶解于pH为3.5～6.0的缓冲液中，加入水解酶，使多糖终浓度为2～10mg/mL，水解酶终浓度为20～60U/mL，之后进行酶解反应，获得降解液；所述酶解反应的条件为：反应温度为30～70℃，反应时间为0.5～4h；将降解液进行水浴处理使酶失活，离心，得上清液Ⅰ；将上清液Ⅰ进行透析，将所得透析液旋蒸浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥，得到坛紫菜降解多糖。

【技术特征摘要】
1.提高坛紫菜多糖生物活性的方法，其特征是包括以下步骤：将坛紫菜粗多糖溶解于pH为3.5～6.0的缓冲液中，加入水解酶，使多糖终浓度为2～10mg/mL，水解酶终浓度为20～60U/mL，之后进行酶解反应，获得降解液；所述酶解反应的条件为：反应温度为30～70℃，反应时间为0.5～4h；将降解液进行水浴处理使酶失活，离心，得上清液Ⅰ；将上清液Ⅰ进行透析，将所得透析液旋蒸浓缩至原体积的20～30％，冷冻干燥，得到坛紫菜降解多糖。2.根据权利要求1所述的提高坛紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：所述多糖终浓度为4mg/mL，水解酶终浓度为50U/mL；所述酶解反应的条件为：反应温度为47.5℃，反应时间为2h。3.根据权利要求2所述的提高坛紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：所述水解酶为果胶酶；所述缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。4.根据权利要求1～3任一所述的提高坛紫菜多糖生物活性的方法，其特征是：将所得坛紫菜降解多糖进行分离纯化，包括以下步骤：①、粗分：向坛紫菜降解多糖中加入去离子水，配制获得浓度为35～45mg/mL的坛紫菜降解多糖溶液，离心，...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅玲琳，周涛，李银停，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33