混菌系统、利用其分解半纤维素的方法及生产酒精的方法技术方案

本发明专利技术提供一种生物质酒精的生产方法，其包含重组至少三组酵母菌以得到至少三组重组酵母菌，重组酵母菌包含表达各组间互不相同的融合蛋白的半纤维素转化菌，该融合蛋白分别为锚定蛋白与各组间互不相同的半纤维素分解酶的组合，且锚定蛋白具有锚定至半纤维素转化菌表面的能力；以及表达五碳糖发酵酶的五碳糖发酵菌；共培养该至少三组重组酵母菌；使半纤维素接触该半纤维素分解酶，以得到五碳糖；以及使五碳糖发酵酶将五碳糖转化为生物质酒精。

【技术实现步骤摘要】
混菌系统、利用其分解半纤维素的方法及生产酒精的方法
本专利技术是关于半纤维素的分解方法。具体而言，本专利技术是关于一种混菌系统、利用其分解半纤维素的方法及生产酒精的方法。
技术介绍
在生物质酒精的工业发展中，目前发展迅速的联合生物转化制程(consolidatedbio-process,CBP)将纤维素水解酶及酒精发酵整合于同一反应器中，从而有效降低生产成本。然而，无论任何制程，生物质原料皆必须先经由水解处理转换为单糖，才可继续进一步的发酵反应。然而，生物质原料中所含的半纤维素，在过往技术中需于酸性环境、高温或高压环境才具有优选的水解效率。但在CBP的制程中，纤维素水解(包含纤维素、半纤维素等)及酒精发酵都要求在酵母菌可存活的环境下进行，无法使用上述方法。故已有尝试将高效率的半纤维素水解酶的序列通过基因转殖技术插入到酵母菌内，使酵母菌本身具有半纤维素水解能力以解决上述问题。然而，半纤维素水解所得到的五碳糖并无有效的利用途径，此情形造成反应槽内的五碳糖浓度持续升高，进而导致酒精制程的效率低下，以及需不断除去多余的五碳糖所造成的成本增加。因此，现有技术也有将可利用五碳糖进行发酵的序列转殖入酵母菌株中，以使酵母菌可同时具有降解半纤维素以及利用五碳糖的能力。但，由于在酵母菌质体中插入过多外源基因，此举又衍生出重组酵母菌存活能力低下的问题。此现象使实际应用时的生物质酒精生产能力受到一定的限制，尚属急需解决的问题之一。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种具可调性的半纤维素水解发酵人工混菌系统，建立分别表达不同半纤维素水解酶的酵母菌株，使各酵母菌株仅表达其中一种水解酶。此外，还独立建立可利用五碳糖进行发酵反应的酵母菌株，并将前述多种菌株整合于单一反应器中以进行CBP制程。本专利技术的混菌系统可同时克服前述的半纤维素水解问题、五碳糖消耗问题、以及重组酵母菌的存活率问题，提供高产率及低成本的生物质酒精生产制程。本专利技术提供一种生物质酒精的生产方法，其包含重组至少三组酵母菌，以得到至少三组重组酵母菌，其中该至少三组重组酵母菌包含至少两组半纤维素转化菌，其表达各组间互不相同的融合蛋白，各组间的该融合蛋白分别为锚定蛋白与各组间互不相同的半纤维素分解酶的组合，且锚定蛋白具有锚定至半纤维素转化菌表面的能力；以及至少一组五碳糖发酵菌，其表达五碳糖发酵酶；共培养该至少三组重组酵母菌；使半纤维素接触该半纤维素分解酶，以得到五碳糖；以及使五碳糖发酵酶将五碳糖转化为生物质酒精。优选地，表达该半纤维素分解酶的基因包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其组合。优选地，表达该融合蛋白的基因包含SEQIDNO:6及SEQIDNO:7。优选地，五碳糖发酵酶包含木糖还原酶、木酮糖激酶或其组合。优选地，生物质酒精的生产方法为重组六组重组酵母菌、共培养六组重组酵母菌、使半纤维素接触该半纤维素分解酶、以及使五碳糖发酵酶将五碳糖转化为生物质酒精。优选地，六组重组酵母菌中包含五组半纤维素转化菌，其分别表达由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4及SEQIDNO:5表达的半纤维素分解酶；以及一组该五碳糖发酵菌，其表达包含木糖还原酶、木酮糖激酶或其组合的五碳糖发酵酶。优选地，该半纤维素转化菌的总细胞数量与该五碳糖发酵菌的细胞数量的比例为4：1。优选地，该半纤维素转化菌中，表达SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4及SEQIDNO:5基因的细胞间数量比例为10～20：5～20：5～15：1～15：30～79。此外，本专利技术还提供了上述生物质酒精的生产方法所利用的一种半纤维素的分解方法，其包括重组至少三组酵母菌，以得到至少三组重组酵母菌，其中重组酵母菌包含：至少两组半纤维素转化菌，其表达各组间互不相同的融合蛋白，且各组间的融合蛋白分别为锚定蛋白与各组间互不相同的半纤维素分解酶的组合，且锚定蛋白具有锚定至半纤维素转化菌表面的能力；共培养重组酵母菌；以及使半纤维素接触半纤维素分解酶，将半纤维素分解酶将半纤维素分解为五碳糖。具体而言，上述提供的生物质酒精生产方法是应用本专利技术提供的半纤维素分解方法而达成的一种混菌系统，其包含共培养的至少三组重组酵母菌，其中重组酵母菌包含至少两组半纤维素转化菌，其表达各组间互不相同的融合蛋白，其分别为锚定蛋白与各组间互不相同的半纤维素分解酶的组合，且锚定蛋白具有锚定至半纤维素转化菌表面的能力；以及至少一组五碳糖发酵菌，表达五碳糖发酵酶。综上所述，本专利技术应用前述的半纤维素分解方法，以提供一种混菌系统，其包含多组分别表达不同半纤维素分解酶的重组酵母菌，且在其间具有特定数量比例时有更佳的半纤维素分解效率。通过本专利技术的混菌系统，可增强现有的生物质酒精生产制程。以往，重组使一组酵母菌仅表达一分解酶被认为是效率低下的作法，然而改进为插入多外源基因造成存活能力低下，使效率提升不如预期。本专利技术跳脱既有的技术偏见，即便仅使一组酵母菌仅表达一种分解酶，但有效利用混菌系统达成现有技术无法达成的效率提升幅度，克服生物质酒精的生产能力限制。此外，本专利技术更以数据证明将半纤维素分解酶固定于酵母菌表面，相较于单纯分泌半纤维素分解酶至外部而不固定，具有更佳的生物质酒精生产效率，可使现有的生物质酒精制程进一步提升。附图说明图1为本专利技术的一实施例的流程图。图2为本专利技术的一实施例的半纤维素转化菌的结构。图3为本专利技术的一例示性实施例中五碳糖发酵菌与未重组酵母菌在富含办纤维素的培养基中的生长情形比较。图4为本专利技术的一例示性实施例中比较组及实施组的示意图。图5为本专利技术的一例示性实施例中控制组、比较组及实施组的酵母菌密度对时间关系图。图6为本专利技术的一例示性实施例中比较组控制组、比较组及实施组的培养基中还原糖类的浓度对时间关系图。图7为本专利技术的一例示性实施例中实施组的酵母菌密度、培养基中的乙醇浓度、及培养基中的还原糖类浓度对时间的关系图。具体实施方式本专利技术提供的半纤维素分解方法，主要手段是将酵母菌分为数个组别，其中，可融合不同半纤维素分解酶与锚定蛋白的基因，并分别插入酵母菌的基因组，使这些组别分泌表达具有不同半纤维素分解酶的融合蛋白。表达的融合蛋白具有锚定蛋白的部分，当其与酵母菌表面接触时会插入至酵母菌表面上，使半纤维素分解酶一并被固定在酵母菌表面上。另一方面，剩余的组别可插入外源基因以表达具有五碳糖发酵功能的酶。接着，将以上所有组别的酵母菌共培养以形成混菌系统。当加入含有半纤维素的生物质原料至混菌系统时，半纤维素可被半纤维素分解酶被分解为五碳糖，而五碳糖可被具五碳糖发酵功能的酶转化为生物质酒精。将此混菌系统应用于联合生物转化制程中，不但可移除原先无法有效利用的五碳糖，达到降低成本及提升生物质酒精的产量的目的。为使上述目的、技术特征以及实际实施后的增益性更为明显易懂，于下文中将是以优选的实施范例辅佐对应相关的图式来进行更详细的说明。在本专利技术的一实施例中，流程如图1所示。在步骤S10中，建立具有五碳糖发酵功能的重组酵母菌，以下称为五碳糖发酵菌YF。五碳糖发酵菌YF的建立是通过插入可表达五碳糖发酵酶的外源基因至未重组的酵母菌Y的基因组，使酵母菌Y表达五碳糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物质酒精的生产方法，其特征在于，包含：重组至少三组酵母菌，以得到至少三组重组酵母菌，其中该至少三组重组酵母菌包含：至少两组半纤维素转化菌，其表达各组间互不相同的融合蛋白，该融合蛋白分别为锚定蛋白与各组间互不相同的半纤维素分解酶的组合，且该锚定蛋白具有锚定至该至少两组半纤维素转化菌表面的能力；以及至少一组五碳糖发酵菌，其表达五碳糖发酵酶；共培养该至少三组重组酵母菌；使半纤维素接触该半纤维素分解酶，以得到五碳糖；以及使该五碳糖发酵酶将该五碳糖转化为生物质酒精。

【技术特征摘要】
1.一种生物质酒精的生产方法，其特征在于，包含：重组至少三组酵母菌，以得到至少三组重组酵母菌，其中该至少三组重组酵母菌包含：至少两组半纤维素转化菌，其表达各组间互不相同的融合蛋白，该融合蛋白分别为锚定蛋白与各组间互不相同的半纤维素分解酶的组合，且该锚定蛋白具有锚定至该至少两组半纤维素转化菌表面的能力；以及至少一组五碳糖发酵菌，其表达五碳糖发酵酶；共培养该至少三组重组酵母菌；使半纤维素接触该半纤维素分解酶，以得到五碳糖；以及使该五碳糖发酵酶将该五碳糖转化为生物质酒精。2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，表达该半纤维素分解酶的基因包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或其组合。3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，表达该融合蛋白的基因包含SEQIDNO:6及SEQIDNO:7。4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，该五碳糖发酵酶包含木糖还原酶、木酮糖激酶或其组合。5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，其是重组六组该酵母菌以得到六组该重组酵母菌，其包含：五组该半纤维素转化菌，分别表达由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4及SEQIDNO:5表达的该半纤维素分解酶；以及一组该五碳糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱一民，魏毓宏，蔡伸隆，
申请(专利权)人：朱一民，长春人造树脂厂股份有限公司，长春石油化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71