人工纤维小体、利用其分解纤维素及生产酒精的方法技术

本发明专利技术提供一种纤维素的分解方法，包含：建立重组噬菌体，其是通过修改噬菌体的基因组，使该噬菌体的表面表达：与分解酶具有亲和性的接合肽，及与细胞的表面的锚定位具有亲和性的锚定肽；使分解酶接触重组噬菌体；以及使纤维素接触该分解酶。

【技术实现步骤摘要】
人工纤维小体、利用其分解纤维素及生产酒精的方法
本专利技术是涉及纤维素的分解方法，特别是关于利用具有噬菌体支架的纤维小体分解纤维素的方法及利用其生产酒精的方法。
技术介绍
已知的生物质酒精制程中，联合生物转化制程(consolidatedbioprocessing,CBP)是为目前最优秀的制程，通过整合生产过程中的所有反应于同一菌株(例：酿酒酵母)中，可大幅降低生产成本及需求。其中，在厌氧热纤梭菌(C.thermocellum)中发现的纤维小体被视为CBP程序发展中的关键技术之一。纤维小体(cellulosome)主要以蛋白支架结构为主体，并于支架结构结合多种纤维素分解酶，以使整体形成具有多种分解功能的复合体，不仅克服了以往透过转基因技术将分解酶表达于细胞表面却受限制的困境，更被证实复合体相较于同样数量的分解酶具有更高的酶活性。然而，纤维小体的构造十分复杂，自然界中又仅于发酵产能不足的厌氧菌中发现其存在，故人工合成纤维小体并通过细胞表面表达技术使其表达于具有高发酵产能的酿酒酵母表面是目前最重要的发展趋势。自然界中所发现的纤维小体，单一小体可连结约96个纤维素分解酶，而现有文献所记载的人工合成纤维小体可连结约达63个纤维素分解酶，相比天然的纤维小体仍有产能上的差距。
技术实现思路
鉴于以上不足，本专利技术提供一种以重组噬菌体作为蛋白支架的纤维小体，通过自组装方式可于单一噬菌体表面连结上百至上千个纤维素分解酶，并锚定于酿酒酵母表面，不仅克服目前分解产能的问题，更可通过噬菌体本身极短的复制周期，得到可高速生产的人工纤维小体，提供高效率的纤维素分解平台。根据上述理由，本专利技术提供一种纤维素的分解方法，包含：建立重组噬菌体，其中重组噬菌体是通过修改噬菌体的基因组，使该噬菌体的表面表达：与分解酶具有亲和性的接合肽，及与细胞表面的锚定位具有亲和性的锚定肽；使分解酶接触重组噬菌体；以及使纤维素接触该分解酶。优选地，接合肽与1至3000个酶连接。优选地，分解酶是内切型纤维素分解酶、外切型纤维素分解酶、纤维双糖分解酶或其组合。优选地，分解酶表达SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或其组合。优选地，锚定位是表达SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或其组合，且与前述分解酶表达的序列不重复。优选地，噬菌体是选自λ噬菌体及丝状噬菌体。优选地，细胞是选自酵母菌。通过上述提供的纤维素分解方法，本专利技术还提供将其用于生产生物质酒精的方法，用以包含：建立重组噬菌体，其中该噬菌体包含接合肽及锚定肽；将分解酶接合至接合肽；将锚定肽锚定于酵母菌的表面的锚定位；使分解酶分解纤维素以得到糖类；以及使酵母菌发酵糖类以得到生物质酒精。此外，本专利技术更提供一种用于上述纤维素分解方法及生物质酒精的生产方法的人工纤维小体，包含：重组噬菌体，其表面表达与分解酶具有亲和性的接合肽；以及与酵母菌的表面的锚定位具有亲和性的锚定肽；以及接合于重组噬菌体表面的接合肽的纤维素分解酶。综上所述，本专利技术提供具有噬菌体支架并接合酶的人工纤维小体，其相较于未接合的酶，具有更高的纤维素分解活性。因此，本专利技术还提供利用该人工纤维小体有效率地分解纤维素的方法，以及利用该方法有效率地生产生物质酒精的用途。附图说明图1为本专利技术中一实施例的流程图。图2为本专利技术中一实施例的重组噬菌体的结构示意图。图3为本专利技术中一实施例的重组噬菌体锚定于酵母菌表面的型态示意图。图4为本专利技术中一实施例的生物反应系统的示意图。图5及图6为本专利技术中一实施例的荧光显微镜照片。图7A至7C为本专利技术中一实施例的酵素活性比较图。【符号说明】S11、S12、S13、S20、S30：步骤RP-BGL-SH3：接合于重组噬菌体表面且具有SH3结构域的纤维双糖分解酶BGL-SH3：具有SH3结构域的纤维双糖分解酶RP-celA-SH3：接合于重组噬菌体表面且具有SH3结构域的内切型纤维素分解酶celA-SH3：具有SH3结构域的内切型纤维素分解酶RP-EC-SH3：接合于重组噬菌体表面且具有SH3结构域的外切型纤维素分解酶EC-SH3：具有SH3结构域的外切型纤维素分解酶具体实施方式现有技术中，人工制造的纤维小体通常是将分解酶直接接合于蛋白支架，以模仿天然纤维小体的结构，然而，可接合的酶数量皆无法达到与天然的纤维小体相当的数量，导致分解能力不如预期。在本专利技术中，蛋白支架上接合分子量较小的肽，再使肽与分解酶连接，克服了立体障碍及其他不利因素，使单一蛋白支架上可接合大量的分解酶。此外，专利技术人更选用噬菌体为主干作为人工纤维小体的蛋白支架，通过基因重组技术使噬菌体表面表达大量的肽，进而增进分解酶的接合量。在本专利技术中，人工纤维小体的建立可使用重组酵母菌及重组噬菌体。其建立方式包含使重组酵母菌表达锚定结构域；以及使重组噬菌体的蛋白质外膜表面表达与纤维素酶具有亲和性的接合肽，并于重组噬菌体的尾端表面表达对应重组酵母菌表达的锚定结构域的锚定肽；且通过大肠杆菌制造大量纤维素酶。将重组噬菌体、重组酵母菌、以及纤维素酶共培养，即可使纤维素酶与表达在重组噬菌体表面的接合肽接合，形成人工纤维小体，同时重组噬菌体可通过锚定肽和重组酵母菌的锚定结构域的亲和性固定于重组酵母菌表面。如此一来，当生物质原料中的纤维素接触到人工纤维小体，人工纤维小体可通过其高密度的纤维素酶进行高效率的纤维素分解，并且，分解产生的六碳糖可直接被所锚定的重组酵母菌利用于发酵反应，以生产生物质酒精。为使上述目的、技术特征以及实际实施后的增益性更为明显易懂，在下文中将以优选的实施范例辅佐对应相关的附图来进行更详细的说明。在本专利技术的一实施例中，流程如图1所示。在步骤S11中，建立重组噬菌体，并通过大肠杆菌(E.coli)快速且大量地生产。重组噬菌体RP的建立是通过修改噬菌体的基因组，使该噬菌体的表面表达与特定酶具有亲和性的接合肽、以及与特定细胞表面的锚定位具有亲和性的锚定肽。具体而言，噬菌体可为λ噬菌体及丝状噬菌体，优选地为丝状噬菌体，如M13、f1、fd噬菌体或其他适用于已知的噬菌体展示(phagedisplay)技术的种类，接合肽可选用任何与所选用的纤维素分解酶具有亲和性的配体，而锚定肽可选用任何与重组酵母菌表达的锚定位具有亲和性的配体。在步骤S12中，建立重组酵母菌，并通过大肠杆菌快速且大量地生产。重组酵母菌的建立是通过修改酵母菌的基因组，使该酵母菌的表面表达锚定位。具体而言，酵母菌可为任何常用于酒精发酵的酵母菌，例如：Schizosaccharomyces属、Saccharomycodes属、Hanseniaspora属酵母菌等；而锚定位可为任何对应于本专利技术的重组噬菌体的锚定肽具有亲和性的锚定结构域。另外，重组酵母菌也可因应需求同时使其表达五碳糖的分解酶，使其具有五碳糖的分解能力。在步骤S13中，建立重组大肠杆菌，并通过大肠杆菌分泌表达大量的欲复制的酶，例如：纤维素分解酶。以复制纤维素分解酶为例，重组大肠杆菌的建立是通过修改大肠杆菌的基因组，使该大肠杆菌可合成纤维素分解酶并分泌至胞外，并使合成的纤维素分解酶表达与重组噬菌体表达的接合肽具有亲和性的对应域，使其与接合肽具有亲和性。大肠杆菌本身因具有快速分裂的特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纤维素的分解方法，其特征在于，包含：建立重组噬菌体，其中该重组噬菌体是通过修改噬菌体的基因组，使该噬菌体的表面表达：至少一种接合肽，与至少一种分解酶具有亲和性；及至少一种锚定肽，与细胞表面的锚定位具有亲和性；使该至少一种分解酶接触该重组噬菌体；以及使纤维素接触该分解酶。

【技术特征摘要】
1.一种纤维素的分解方法，其特征在于，包含：建立重组噬菌体，其中该重组噬菌体是通过修改噬菌体的基因组，使该噬菌体的表面表达：至少一种接合肽，与至少一种分解酶具有亲和性；及至少一种锚定肽，与细胞表面的锚定位具有亲和性；使该至少一种分解酶接触该重组噬菌体；以及使纤维素接触该分解酶。2.如权利要求1所述的分解方法，其特征在于，该至少一种接合肽与1至3000个该至少一种分解酶连接。3.如权利要求1所述的分解方法，其特征在于，该至少一种分解酶包含内切型纤维素分解酶、外切型纤维素分解酶、纤维双糖分解酶或其组合。4.如权利要求1所述的分解方法，其特征在于，该至少一种分解酶表达SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或其组合。5.如权利要求4所述的分解方法，其特征在于，该锚定位表达SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱一民，魏毓宏，蔡伸隆，
申请(专利权)人：朱一民，长春人造树脂厂股份有限公司，长春石油化学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71