一种基于酿酒酵母孢子的微胶囊固定化酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于酿酒酵母孢子的微胶囊固定化酶的制备方法，属于微生物和固定化酶技术领域。本发明专利技术将酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，然后分离纯化获得含有固定化酶的孢子。相比游离酶，本发明专利技术制备的固定化酶更加稳定，可抵御不同水解酶的侵袭和耐受较高温度，同时可以重复利用多次。

【技术实现步骤摘要】
—种基于酿酒酵母孢子的微胶囊固定化酶的制备方法
本专利技术涉及，属于微生物和固定化酶
。
技术介绍
酵母菌泛指能发酵糖类的一大类单细胞真菌，最典型的酵母菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。酿酒酵母在良好的营养和生长条件下,生长迅速，以出芽繁殖的方式进行生殖。但以醋酸盐为唯一或主要碳源，并辅以缺乏氮源等特定条件下，如只有乙酸钾存在，酿酒酵母就会以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，此时的细胞即称为子囊。子囊经自然或人为破壁后，可释放出其中的子囊孢子。对于子囊孢子来说，其孢子壁由四层组成，从内到外依次为:甘露糖层，葡聚糖层，壳聚糖层和二酪氨酸层。固定化酶能提高酶的稳定性，并且可以反复循环利用，在工业化生产方面优势更加明显。本专利技术基于酿酒酵母孢子的微胶囊固定化技术是一种新的固定化酶技术，通过分子生物学的方法使目的蛋白在酵母产孢过程中表达固定到孢子壁上壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，并保持相对独立的空间结构和生物活性。这种独特的空间定位使其相对于游离酶而言具有很多优良特性，如温度(有机溶剂、蛋白酶)稳定性、重复使用性、无需蛋白纯化和固定化操作、降低生产成本等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，是构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。所述酶是α -半乳糖苷酶、蔗糖酶或植酸酶。所述表达定位通过信号肽引导酶表达在周质间隙。所述方法包括以下步骤:(I)将带有自身信号肽的α -半乳糖苷酶基因MELl (SEQ ID N0.1)融合插入到质粒 pRS424-TEFpr，得到重组质粒 pRS424-TEFpr_MELl ；所述α -半乳糖苷酶基因(MELl)来源于酵母。(2)将得到的重组质粒pRS424-TEFpr-MELl通过醋酸锂/PEG的转化方法转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母；(3)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp培养基中，28°C~32°C培养，过夜；所述SD-Trp培养基成分为无氨基酸酵母氮源、去离子水，灭菌后，补加单独灭菌的葡萄糖和不含色氨酸的氨基酸混合 物；(4)将步骤⑶中的菌液转接到YPAce培养基中，28°C~32°C摇床12h~16h ;所述YPAce培养基成分为酵母提取物、蛋白胨、腺嘌呤以及醋酸钾；(5)离心收集步骤⑷中的菌体，清洗，然后用1.5%~3% (m/v)醋酸钾重悬，28°C ~32°C 摇床 24h ~48h ；(6)收集重组酿酒酵母细胞，用PBS溶液洗2~3次，然后再用PBS溶液重悬；(7)向步骤(6)中的细胞悬浮液加入lyticase (溶壁酶)，冰上超声；(8)用PBS溶液将步骤(7)的破碎细胞洗2~3次，弃去上清得到酿酒酵母重组孢子;(9)纯化酿酒酵母重组孢子。所述培养温度优选30°C，醋酸钾浓度优选2 %。所述步骤(9)中酿酒酵母重组孢子的纯化:将得到的酿酒酵母重组孢子用TritonX-100溶液洗涤，然后将孢子悬浮在Triton X-100溶液中；配制不同浓度梯度的Percoll溶液；将不同浓度梯度的Percoll溶液按照从高浓度到低浓度依次加入到离心管中，最后加孢子悬浮液，离心后，溶液分层，纯净的孢子将会位于离心管的底部，将上层液体和细胞碎片除去，用PBS溶液洗涤孢子2~3次，冷冻干燥。所述SD-Trp培养基优选无氨基酸酵母氮源与去离子水的质量百分比为0.67%，葡萄糖终浓度2 %，氨基酸混合物终浓度0.67 %。其中，氨基酸混合物粉末成分及比例如下:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微胶囊固定化酶的制备方法，其特征在于，构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。

【技术特征摘要】
1.一种微胶囊固定化酶的制备方法，其特征在于，构建表达目的酶的重组酿酒酵母，培养重组酿酒酵母使其以孢子生殖的方式进行繁殖，在胞内形成孢子，目的酶表达定位在酿酒酵母孢子的壳聚糖层和二酪氨酸层之间的周质间隙，收集孢子获得固定化酶。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶是α-半乳糖苷酶，编码所述α -半乳糖苷酶及其自身信号肽的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酶在信号肽的引导下表达在周质间隙。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶是蔗糖酶或植酸酶。5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将带有自身信号肽的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pRS424-TEFpr，得到重组质粒 pRS424-TEFpr-MELl ； (2)将得到的重组质粒pRS424-TEFp,-MELl转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母； (3)将重组酿酒酵母接种到SD-Trp培养基中，28°C~32°C培养，过夜； (4)将步骤(3)中的菌液转接到YPAce培养基中，28°C~32°C摇床12h~16h； ...

【专利技术属性】
技术研发人员：中西秀树，高晓冬，施李兵，李子杰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32