一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种酶解制备低分子量κ‑卡拉胶钾的方法，包括如下步骤：(1)在40‑50℃水浴锅中，将κ‑卡拉胶粉末配成质量浓度为0.5‑1.5％的κ‑卡拉胶水溶液，搅拌均匀，加入κ‑卡拉胶酶，搅拌酶解6‑8h；(2)酶解液进行醇沉，得到低分子量κ‑卡拉胶寡糖；(3)将得到的κ‑卡拉胶寡糖配制成质量浓度4‑10％的溶液，与质量浓度0.1％‑2％的氯化钾水溶液混合，对混合液进行醇洗除盐，得到低分子量的κ‑卡拉胶钾。本发明专利技术方法步骤简单，条件温和，制备得到的低分子量κ‑卡拉胶钾的分子量稳定在较小范围内，且钾离子结合率高，可作为食品添加剂添加到食品中作为保健品，也可以制备成药物作为预防或治疗高血压的药品。

A method for preparing low molecular weight kappa-carrageenan potassium by enzymatic hydrolysis and its application

The invention discloses a method for preparing low molecular weight kappa carrageenan potassium by enzymatic hydrolysis, which comprises the following steps: (1) in a water bath at 40 50 C, the kappa carrageenan powder is prepared into a 0.5 1.5% kappa carrageenan aqueous solution with a mass concentration of 0.5 1.5%, stirred evenly, added with kappa carrageenase, stirred for 6 8 h; (2) alcoholic precipitation of the enzymatic hydrolysate to obtain low molecular weight kappa carrageenan oligosaccharide; (3) The obtained kappa-carrageenan oligosaccharides were mixed with 0.1%2% potassium chloride aqueous solution at a mass concentration of 4 10%. The mixed solution was washed by alcohol to remove salt and low molecular weight kappa-carrageenan potassium was obtained. The method has the advantages of simple steps, mild conditions, stable molecular weight of the prepared low molecular weight kappa carrageenan potassium in a small range, high potassium ion binding rate, and can be added to food as a health product as a food additive, and can also be prepared as a drug for preventing or treating hypertension.

【技术实现步骤摘要】
一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用
本专利技术涉及低分子量κ-卡拉胶钾制备
，更具体的说是涉及一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用。
技术介绍
海洋藻类作为海洋中有机物的原始生产者，具有特殊的碳水化合物和人类正常生理代谢所不可缺少的矿物质。海藻多糖是指海藻中具有高粘度和凝固能力的各种高分子碳水化合物。随着海洋药物近年来的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视。κ-卡拉胶作为海洋三大藻类之一的红藻的提取物，以其独特的理化性质和广泛的用途，为当代生物学、生物化学和医药界所关注，目前已成为一个研究热点。κ-卡拉胶是由1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架交替连接而成的线性硫酸多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等细胞壁中。κ-卡拉胶用于食品工业，可做凝固剂、粘合剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂等，广泛用于乳制品、饮料、牛乳布丁、咖啡、果冻、罐头等食品工业上。此外，κ-卡拉胶还具有很重要的生物活性，如皮下注射κ-卡拉胶能促进结缔组织和骨胶原的生长，增加骨骼对钙的吸收；κ-卡拉胶对类风湿性关节炎有疗效，通过皮下注射或静脉注射κ-卡拉胶的多糖复合液后，可阻止滑膜中的成粒作用，使滑膜细胞明显增生，起到治疗作用；κ-卡拉胶在病理研究方面还表现出能防治胃溃疡和十二指肠溃疡，这是由于酸能降解κ-卡拉胶，以调节胃粘液中硫含量，防止溃疡的发生，且可与粘膜层上粘蛋白结合形成更具抵抗力的膜性结构，对胃肠粘膜起保护作用；κ-卡拉胶在抗病毒、抗凝血及免疫方面亦具有重要的生理活性。然而，目前几乎没有对低分子量κ-卡拉胶钾降血压方面的研究，也没有任何分子量范围κ-卡拉胶钾制备工艺的研究。因此，如何提供一种步骤简单、条件温和且能够酶解制备具有降压作用的低分子量κ-卡拉胶钾的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种酶解制备具有降压作用的低分子量κ-卡拉胶钾的方法，以红藻来源的精制κ-卡拉胶粉为原料，经特定酶酶解、醇沉后获得分子量为1-4kDa的低分子量κ-卡拉胶寡糖，经钾盐混合处理后，得到低分子量κ-卡拉胶钾。本专利技术步骤简单，条件温和，制备得到的低分子量κ-卡拉胶钾分子量稳定在较小范围内，且钾离子含量高。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，包括如下步骤：(1)在40-50℃水浴锅中，将κ-卡拉胶粉末配成质量浓度为0.5-1.5％的κ-卡拉胶水溶液，搅拌均匀，加入κ-卡拉胶酶，搅拌酶解6-8h；(2)酶解液进行醇沉，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖；(3)将得到的κ-卡拉胶寡糖配制成质量浓度为4-10％的溶液，与质量浓度0.1-2％的氯化钾水溶液混合；对混合液进行醇洗除盐，得到低分子量的κ-卡拉胶钾。优选地，步骤(1)中κ-卡拉胶的分子量为100-700kDa，钾离子含量为6.0-6.5％；κ-卡拉胶的来源为麒麟菜、石花菜、鹿角菜等天然红藻。酶解底物分子量较大，钾离子含量低，在特定的酶解条件下使用κ-卡拉胶酶进行酶解，制备得到低分子量κ-卡拉胶寡糖分子量稳定，生物活性高。优选地，步骤(1)中初始添加κ-卡拉胶酶所占体积分数为0.5-3％。酶解形式为一次性加酶，酶解中间过程不再补加酶液。进一步优选地，添加1％的κ-卡拉胶酶，原始pH条件下40℃酶解8h。κ-卡拉胶酶添加量、酶解时间、酶解温度均保证了酶解产物的稳定性。优选地，编码κ-卡拉胶酶的基因如SEQIDNO:1所示。进一步优选地，κ-卡拉胶酶的制备方法如下：1)设计上游引物F1：5’-CGGGGTACCATGACAAAACTAAAGTTTAACGGC-3’，SEQIDNO:2；以及下游引物R1：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGCCGAAGTTCCGGGCG-3’，SEQIDNO:3；PCR扩增后得到的SEQIDNO:1所示PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，电泳成像后将目的条带与空载体pPIC9K分别进行AvrII与NotI双酶切，将目的基因与载体过夜连接，连接产物转化至DH-5α感受态细胞，阳性克隆培养并提取质粒，采用电穿孔仪导入到毕赤酵母体内，培养，挑选重组毕赤酵母。2)将所挑选的重组毕赤酵母接种到YPD培养基中，26-32℃培养20-24h；以0.5-2％接种量接种于BMGY发酵液培养基中培养36-48h，加入甲醇，20-24℃培养20-24h，重复加甲醇3-4次继续培养，培养结束后离心得到上清液即κ-卡拉胶酶。优选地，甲醇添加量为1-2％。进一步优选地，甲醇添加量为1％。特定甲醇添加量的可以诱导κ-卡拉胶酶的酶解表达。优选地，步骤(2)中低分子量κ-卡拉胶寡糖的分子量为1-4kDa；低分子量κ-卡拉胶寡糖包括κ-卡拉胶二十二糖和κ-卡拉胶二十四糖，两者所占比例均为40％以上。优选地，步骤(2)中醇沉方法如下：1)酶解液离心，取上清，加入95％乙醇，使酒精计读数在45-55％，冷藏静置1-2h；2)取上清，浓缩5-6倍，加入95％乙醇使酒精计读数在75-78％，冷藏静置1-2h；3)取沉淀，溶于水，旋转蒸发，冷冻干燥，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖。优选地，步骤(3)中的低分子量κ-卡拉胶钾的分子量为1-4kDa。优选地，步骤(3)中低分子量κ-卡拉胶钾的钾离子含量为8.2-8.8％。优选地，步骤(3)中具体步骤如下：1)配制质量浓度4-10％的κ-卡拉胶钾寡糖溶液，与质量浓度0.1-2％氯化钾等体积混合，混合液旋蒸浓缩1倍，加入95％乙醇，使酒精计读数在75-78％之间，静置1-2h，离心，取沉淀；2)沉淀用水复溶到混合液旋蒸后的体积，再次加入95％乙醇使酒精计读数在75-78％之间，静置1-2h，离心，取沉淀；3)沉淀复溶旋蒸去除乙醇，冷冻干燥得低分子量κ-卡拉胶钾。进一步优选地，κ-卡拉胶钾寡糖溶液质量浓度为4-8％，氯化钾质量浓度为0.1-1％。上述一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法制备的低分子量κ-卡拉胶钾在制备预防或治疗高血压药物中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，将大分子κ-卡拉胶粉末溶于水后，加入κ-卡拉胶酶酶解，再和氯化钾溶液混合，得到的低分子量κ-卡拉胶钾纯度高，钾离子含量高，既可作为食品添加剂，又可用作药品以及功能食品。附图说明下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶钾一次醇洗的盐峰图；图2附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶钾二次醇洗的盐峰图；图3附图为大分子κ-卡拉胶GPC图；图4附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶寡糖GPC图；图5附图为实施例1中低分子量κ-卡拉胶钾GPC图；图6附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶钾一次醇洗的盐峰图；图7附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶钾二次醇洗的盐峰图；图8附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶寡糖GPC图；图9附图为实施例2中低分子量κ-卡拉胶钾GPC图；图10附图为对比例1中κ-卡拉胶寡糖GPC图；图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶解制备低分子量κ‑卡拉胶钾的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在40‑50℃水浴锅中，将κ‑卡拉胶粉末配成质量浓度为0.5‑1.5％的κ‑卡拉胶水溶液，搅拌均匀，加入κ‑卡拉胶酶，搅拌酶解6‑8h；(2)酶解液进行醇沉，得到低分子量κ‑卡拉胶寡糖；(3)将得到的κ‑卡拉胶寡糖配制成质量浓度为4‑10％的溶液，与质量浓度0.1‑2％的氯化钾水溶液混合；对混合液进行醇洗除盐，得到低分子量的κ‑卡拉胶钾。

【技术特征摘要】
1.一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在40-50℃水浴锅中，将κ-卡拉胶粉末配成质量浓度为0.5-1.5％的κ-卡拉胶水溶液，搅拌均匀，加入κ-卡拉胶酶，搅拌酶解6-8h；(2)酶解液进行醇沉，得到低分子量κ-卡拉胶寡糖；(3)将得到的κ-卡拉胶寡糖配制成质量浓度为4-10％的溶液，与质量浓度0.1-2％的氯化钾水溶液混合；对混合液进行醇洗除盐，得到低分子量的κ-卡拉胶钾。2.根据权利要求1所述的一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，其特征在于，所述步骤(1)中κ-卡拉胶的分子量为100-700kDa，钾离子含量为6.0-6.5％；κ-卡拉胶的来源为天然红藻。3.根据权利要求1所述的一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，其特征在于，所述步骤(1)中初始添加κ-卡拉胶酶的体积分数为0.5-3％。4.根据权利要求1所述的一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，其特征在于，编码所述κ-卡拉胶酶的基因如SEQIDNO:1所示。5.根据权利要求1所述的一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法，其特征在于，所述步骤(2)中低分子量κ-卡拉胶寡糖的分子量为1-4kDa；低分子量κ-卡拉胶寡糖包括κ-卡拉胶二十二糖和κ-卡拉胶二十四糖，两者所占比例均为40％以上。6.根据权利要求1所述的一种酶解制备低分子量κ...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟海津，陈梦，韩振莲，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37