一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种使CAR的表达受控于内源性启动子的生理性通用型CAR‑T细胞及其制备方法和用途。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TCR恒定区基因，同时使用AAV介导的基因同源重组技术在TCR恒定区精准插入CAR基因。从而获得受内源性启动子调控的CAR表达，将CAR的表达水平控制在正常生理范围内的通用型CAR‑T。这种CAR‑T的特点可异体输注，CAR的表达处于生理水平且均匀一致，没有显著的细胞因子风暴，更安全。本发明专利技术还涉及所述CAR‑T细胞的在抗肿瘤方面的应用。

A universal CAR-T cell and its preparation method and Application

The present invention discloses a physiological universal CAR T cell which makes the expression of CAR controlled by an endogenous promoter, a preparation method and application thereof. CRISPR/Cas9 gene editing technique was used to knock out TCR constant region gene, and AAV-mediated gene homology recombination technique was used to insert CAR gene precisely in TCR constant region. Thus, the expression of CAR regulated by endogenous promoter was obtained, and the expression level of CAR was controlled in the normal physiological range. This kind of CAR T is characterized by allogeneic transfusion. The expression of CAR is at physiological level and uniform. There is no significant cytokine storm and it is safer. The invention also relates to the application of the CAR T cells in anti-cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途
本专利技术涉及生物医药领域，具体地涉及通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途。
技术介绍
CAR-T是利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原的经过改造的T细胞。近年来，CD19抗原特异性CAR-T细胞用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤临床试验中，显示出极高的反应率及持续的疾病缓解效果。嵌合抗原受体(CAR)赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相对于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。近年来，CAR-T技术在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T治疗的原理如下：通过基因工程修饰，使体外分离收集的癌症患者的T细胞表达识别单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并在体外大量扩增CAR-T细胞后将其输回癌症患者体内进行细胞免疫治疗。CAR作为一种基因表达的嵌合蛋白包含与T细胞信号传导结构域连接的、抗体的抗原结合结构域(如：单链抗体scFv)。CAR-T细胞过继性免疫的显著优势在于：细胞免疫治疗更具精确性。CAR-T细胞过继免疫治疗系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通用型CAR‑T细胞，其特征在于，所述T细胞的TCR恒定区基因敲除，并在敲除的原位同源重组一段编码CAR基因的序列。

【技术特征摘要】
1.一种通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞的TCR恒定区基因敲除，并在敲除的原位同源重组一段编码CAR基因的序列。2.如权利要求1所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述同源重组是通过重组腺相关病毒载体实现的。3.如权利要求2所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述同源重组发生在T细胞的TCR恒定区基因的外显子前。4.如权利要求2或3所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列(5’ITR)、3’末端反向重复序列(3’ITR)及编码CAR基因的序列。5.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体进一步包含如下操作性连接的序列元件：SA序列、2A序列、PolyA序列、5’HA序列、3’HA和5’、3’末端反向重复序列。6.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体中所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQIDNO:4所示的序列。7.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体中所述的5’基因组同源序列(5’HA)包含SEQIDNO:1所示的序列；所述的SA序列包含SEQIDNO:2所示的序列；所述的2A序列包含SEQIDNO:3所示的序列；；所述的PolyA序列包含SEQIDNO:5所示的序列；所述的3’基因组同源序列(3’HA)包含SEQIDNO:6所示的序列；所述的5’末端反向重复序列包含SEQIDNO:7所示的序列；3’末端反向重复序列包含SEQIDNO:8所示的序列。8.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包含与SEQIDNO:9所示的序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。9.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，在同源重组之前，所述T细胞事先经CRISPR/cas9系统敲除TCR基因。10.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述敲除TCR基因是通过将T细胞、Cas9蛋白与sgRNA混合进行电转实现的。11.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述sgRNA来源于TCR恒定区域外显子上下游各250bp。12.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述sgRNA包含与SEQIDNO:13所示的序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。13.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，其中所述细胞来源于健康志愿者。14.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，其中所述CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区。15.一种制备通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括如下步骤：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦志华，朱滨，董明洁，
申请(专利权)人：北京门罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11