一种基因改造的γδT细胞制造技术

本发明专利技术提供一种基因改造的γδT细胞，其特征在于，所述γδT细胞中转入了高亲和力的αβTCR基因，并且所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力是其相应的野生型αβTCR的至少两倍。本发明专利技术γδT细胞无需共转其它CD分子即可实现对肿瘤抗原的特异性识别，本发明专利技术的γδT细胞具有优异的激活功能和靶细胞杀伤效力。此外，本发明专利技术的γδT细胞的制备方法及工艺更加简便。

A Genetically Modified Gamma Delta T Cell

The invention provides a genetically modified gamma delta T cell, which is characterized in that the gamma delta T cell is transfected with a high affinity alpha beta TCR gene, and the affinity of the high affinity alpha beta TCR with its specific pMHC is at least twice that of the corresponding wild type alpha beta TCR. The gamma delta T cells of the invention can realize specific recognition of tumor antigens without co-transformation of other CD molecules. The gamma delta T cells of the invention have excellent activation function and killing effect on target cells. In addition, the preparation method and process of the gamma delta T cells of the present invention are more convenient.

【技术实现步骤摘要】
一种基因改造的γδT细胞
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及改造的γδT细胞，以及所述细胞的用途及制备方法。
技术介绍
恶性肿瘤是危害人类健康的最危险的疾病之一。全球每年约800万人死于癌症，在我国平均每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤，开发治疗恶性肿瘤的新药物和新疗法已经成为全球的焦点。肿瘤免疫疗法被《Science》评为2013年最重大的科学突破之首，其中过继性细胞免疫治疗尤为引人关注。过继性细胞免疫治疗是把病人自体的免疫细胞在体外扩增或修饰后，再回输入其体内，从而达到治疗肿瘤的目的。该疗法特异性高，副作用少，尤其适用于晚期无法进行其他治疗的患者，目前T淋巴细胞成为了过继性细胞免疫疗法的时代新星。T淋巴细胞，依据其表面的T细胞受体(TCR)结构，分为αβT和γδT细胞两大类。人的γδT细胞是一类在进化上保守的独特的T淋巴细胞亚群，其TCR受体是有γ链和δ链组成；在机体的免疫监控中具有抗感染和抗肿瘤的作用。γδT细胞的种类丰富，具有多种亚型构成，其中，Vδ链有1-8，Vγ链有1-9不同亚型。在人的外周血中，γδT细胞占整个T淋巴细胞的1％-5％，其中，Vγ9Vδ2γδT细胞占整个γδT细胞的50％-95％。同αβT细胞相比，γδT细胞识别的抗原识种类更广泛，且无主要组织相容性复合体(MHC)的限制。当前，T细胞过继性免疫治疗的研究主要集中在CAT-T疗法和TCR-T疗法两大方面，其中TCR-T疗法主要是使用改造过的TCR基因修饰T细胞。和目前主要使用的αβTCR转导的αβT细胞方案相比，αβTCR转导γδT细胞有着天然的优势：其外源性αβTCR几乎不会和γδT细胞内源性γ链和δ链发生错配，避免了可能对机体造成的自身免疫反应。2009年，日本学者AHiasa等[AHiasa1GeneTherapy(2009)16,620–628]首次将αβTCR转导到γδT细胞，发现αβTCR转导的γδT细胞既可以通过本身的γδTCR向细胞内传递激活信号，又可以通过外源性αβTCR对特异性抗原产生应答反应，同时从激活动力上对比，αβTCR转导的γδT细胞较αβTCR转导的αβT细胞反应更加迅速。然而，其方案中采用的是未改造的野生型αβTCR，如果单独将αβTCR转导γδT细胞后，无法实现对肿瘤抗原的特异性识别，最终他们只能同时再转导CD8分子来协助识别。这无疑增加了细胞的不稳定性，并且额外的基因编辑会带来更多的不可预测性和潜在风险性。因此，本领域急需无需共转其它CD分子的特异性识别肿瘤抗原的γδT细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种γδT细胞，所述γδT细胞无需共转其它CD分子即可特异性识别肿瘤抗原。本专利技术的目的还在于提供所述γδT细胞的制备方法和用途。在第一方面，本专利技术提供一种基因改造的γδT细胞，所述γδT细胞中转入了高亲和力的αβTCR基因，并且所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力是其相应的野生型αβTCR的至少两倍。在优选的实施方式中，所述基因改造的γδT细胞无需外源性CD8分子即可特异性识别肿瘤抗原；优选地，所述基因改造的γδT细胞无需任何外源性CD分子即可特异性识别肿瘤抗原；最优选地，所述基因改造的γδT细胞无需任何外源性辅助分子即可特异性识别肿瘤抗原。在具体的实施方式中，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力的平衡解离常数数值KD≤10μM。在具体的实施方式中，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力的平衡解离常数值KD≤4μM；例如，5nM≤KD≤4000nM、50nM≤KD≤4000nM、100nM≤KD≤4000nM、400nM≤KD≤4000nM、450nM≤KD≤4000nM、400nM≤KD≤3000nM、500nM≤KD≤3000nM、1000nM≤KD≤3000nM或1500nM≤KD≤3000nM。在具体的实施方式中，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力的平衡解离常数值KD为：1nM≤KD≤2000nM；例如，100nM≤KD≤2000nM、400nM≤KD≤2000nM、450nM≤KD≤2000nM、500nM≤KD≤2000nM、1000nM≤KD≤2000nM或1500nM≤KD≤2000nM。在优选的实施方式中，所述高亲和力的αβTCR基因是全长的。在优选的实施方式中，所述高亲和力的αβTCR的α链的核酸序列为SEQIDNO:5，β链的核酸序列为SEQIDNO:7；或者，α链的核酸序列为SEQIDNO:9，β链的核酸序列为SEQIDNO:11；或者，α链的核酸序列为SEQIDNO:13，β链的核酸序列为SEQIDNO:15；或者，α链的核酸序列为SEQIDNO:17，β链的核酸序列为SEQIDNO:19；或者α链的核酸序列为SEQIDNO:21，β链的核酸序列为SEQIDNO:23。在优选的实施方式中，所述高亲和力αβTCR是通过病毒载体，包括但不限于慢病毒载体转导进入所述γδT细胞。在优选的实施方式中，所述γδT细胞的γδ配对为Vγ1-9和Vδ1-8。在优选的实施方式中，所述细胞是Vγ9Vδ2γδT细胞。在具体的实施方式中，所述γδT细胞用于制备治疗肿瘤或感染性疾病的药物。在具体的实施方式中，所述感染为病毒感染或细菌感染。在优选的实施方式中，其特征在于，所述γδT细胞来自于治疗对象自身或来自健康供体。在第二方面，本专利技术提供第一方面所述的γδT细胞的用途，用于制备治疗肿瘤或感染性疾病的药物。在优选的实施方式中，所述感染性疾病为病毒感染或细菌感染。在第三方面，本专利技术提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及第一方面所述的γδT细胞。在第四方面，本专利技术提供一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的第一方面所述的γδT细胞或第三方面所述的药物组合物。在优选的实施方式中，所述疾病为肿瘤或感染性疾病。在优选的实施方式中，所述感染性疾病为病毒感染或细菌感染。在第五方面，本专利技术提供一种制备第一方面所述γδT细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将高亲和力的αβTCR基因转导进入γδT细胞；(ii)培养(i)中所述γδT细胞。在优选的实施方式中，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力是其相应的野生型αβTCR的至少两倍。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1a-x依次显示了针对1G4的32μMTCR(野生型)、4μMTCR、1.07μMTCR、450nMTCR、84nMTCR和5nMTCR的α链的核酸序列和对应的氨基酸序列及β链的核酸序列和对应的氨基酸序列；图2显示了不同亲和力的1G4TCR转导的γδT细胞组在T2负载特异性短肽和对照短肽及不负载短肽时的细胞因子(IFN-γ)的释放反应；图3显示了不同亲和力的1G4TCR转导的γδT细胞组在肿瘤细胞系上的细胞因子(IFN-γ)的释放反应；图4显示了1G4TCR转导的γδT细胞组对肿瘤细胞系的特异性杀伤对比：LDH检测；图5显示了用荧光素酶反应检测1G4TCR转导的γδT细胞对肿瘤细胞系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因改造的γδT细胞，其特征在于，所述γδT细胞中转入了高亲和力的αβTCR基因，并且所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力是其相应的野生型αβTCR的至少两倍。

【技术特征摘要】
1.一种基因改造的γδT细胞，其特征在于，所述γδT细胞中转入了高亲和力的αβTCR基因，并且所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力是其相应的野生型αβTCR的至少两倍。2.如权利要求1所述的γδT细胞，其特征在于，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力的平衡解离常数数值KD≤10μM。3.如权利要求1所述的γδT细胞，其特征在于，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力的平衡解离常数值KD≤4μM；例如，5nM≤KD≤4000nM、50nM≤KD≤4000nM、100nM≤KD≤4000nM、400nM≤KD≤4000nM、450nM≤KD≤4000nM、400nM≤KD≤3000nM、500nM≤KD≤3000nM、1000nM≤KD≤3000nM或1500nM≤KD≤3000nM。4.如权利要求1所述的γδT细胞，其特征在于，所述高亲和力的αβTCR与其特异性pMHC的亲和力的平衡解离常数值KD为：1nM≤KD≤2000nM；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，周佩佩，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44