一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种分泌型靶向CD133的CAR‑T细胞，包括分泌PD‑1抗体且靶向CD133的CAR‑T细胞；分泌IL12细胞因子且靶向CD133的CAR‑T细胞。本发明专利技术还公开了此分泌PD‑1抗体或IL12的CAR‑T细胞的制备方法以及该CAR‑T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。本发明专利技术CAR‑T细胞分泌的PD‑1抗体，特异性的与T细胞表面的PD‑1相结合，阻断PD‑1/PD‑L1信号对T细胞活性的抑制反应，有利于CAR‑T长时间对肿瘤细胞生长产生有效的抑制；本发明专利技术CAR‑T细胞分泌的IL12细胞因子，可作用于肿瘤抑制性免疫微环境中的免疫抑制细胞，降低其免疫抑制能力，进而增强CAR‑T细胞的杀伤效果。

A Secretory Targeted CD133 CAR-T Cell and Its Preparation and Application

The invention discloses a secretory CAR T cell targeting CD133, including a CAR T cell secreting PD 1 antibody and targeting CD133, and a CAR T cell secreting IL12 cytokines and targeting CD133. The invention also discloses the preparation method of the CAR T cell secreting PD_1 antibody or IL12 and the application of the CAR T cell in the preparation of anti-tumor cell therapeutic drugs. The anti-PD 1 antibody secreted by the CAR T cell of the present invention specifically combines with the PD1 on the surface of the T cell to block the inhibitory response of the PD 1/PD L1 signal to the activity of T cell, which is beneficial to the effective inhibition of the growth of tumor cells by the CAR T cell for a long time; the IL12 cytokine secreted by the CAR T cell of the present invention can act on the immunosuppressive cells in the tumor suppressive immune microenvironment and reduce the activity of the T cell. It has low immunosuppressive ability, and then enhances the killing effect of CAR T cells.

【技术实现步骤摘要】
一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用
本研究涉及医学生物领域，具体涉及一种靶向CD133且分泌PD-1抗体或IL12细胞因子的CAR-T细胞。此外，本专利技术还涉及该细胞的制备方法及应用。
技术介绍
近年来，肿瘤免疫治疗的临床应用已经取得了显著进展，成为继手术、放疗、化疗和靶向治疗的另一种有效的肿瘤治疗手段。在多种肿瘤免疫治疗方法中，嵌合抗原受体（ChimericAntigenreceptor，CAR）修饰的T淋巴细胞（CAR-modifiedTlymphocyte，CAR-T）疗法被证实是一种针对恶性肿瘤极具前景的治疗手段。大量的临床数据表明，针对CD19的CAR-T细胞对难治性或恶性B细胞淋巴瘤有很好的治疗效果，特别是对急性或慢性淋巴性白血病以及霍奇金淋巴瘤，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。目前针对CD19特异的CAR-T疗法——KymriahandYescarta，用于治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，已在美国批准上市。CAR-T是一种通过把患者自己的防御细胞（T细胞）取出来，人工（依靠基因技术）加上一种能够识别癌症细胞的部件（癌细胞识别抗原受体），并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。嵌合抗原受体（CAR）是CAR-T的核心部件，使得免疫细胞HLA具有非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。CAR分子的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区（SinglechainantibodyFragment，scFv），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。其中scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性是关键的决定因素。CD133是人类干/祖细胞膜上发现的一种跨膜糖蛋白，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志。近年来，越来越多的研究表明，CD133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异性标记分子，在超过50%的肝细胞癌（HCC）中均检测到CD133的高表达。此外，在多种实体瘤中均有CD133的较高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、肺癌，结肠癌、胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌等。已有报道表明，在晚期肝癌患者中，检测到较高的CD133表达，且CD133的高表达也预示着较差的预后。此外，CD133作为肿瘤干细胞（CSCs）和内皮祖细胞的标志物，已被证实与肿瘤发生、转移、侵袭、耐药及复发等密切相关。因此，CD133的这些特性使其成为CD133表达阳性的晚期肿瘤患者免疫治疗的理想靶点。已报道的靶向CD133阳性细胞的方法包括抗CD133的免疫毒素、双特异性抗体等，均显示了一定应用前景。此外，靶向肿瘤干细胞靶点CD133的嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞或NK细胞可以特异性杀伤病人的脑胶质瘤干细胞或卵巢癌干细胞。在一个晚期胆管癌患者中，CD133特异性的CAR-T细胞治疗使其获得了持续4.5个月的部分响应。虽然CAR-T细胞免疫治疗在动物模型和患者身上表现了令人振奋的作用，但二代、三代CAR-T细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战，主要包括：缺乏肿瘤特异性抗原，从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险；T细胞难以有效的到达肿瘤部位，CAR-T细胞浸润实体瘤的能力不足、存活时间短，以及一系列的免疫抑制分子及免疫抑制肿瘤微环境等均会限制CAR-T细胞的抗肿瘤疗效，如T细胞膜蛋白3（TIM-3）、淋巴细胞激活因子3（LAG-3）、细胞毒性T淋巴细胞-4（CTLA-4）、程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）及其两个主要配体PD-L1、PD-L2等。肿瘤抑制性免疫微环境是CAR-T在实体瘤中疗效不佳的重要原因。白细胞介素12（Interleukin-12，IL-12）是一种由P35（IL12A）和P40（IL-12B）两条链组成的异源二聚体，是一种促炎细胞因子，主要由树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞分泌，可激活自然杀伤（NK）细胞，诱导IFN-γ的产生，增强吞噬细胞的吞噬和释放炎性细胞因子的能力，也可作用于肿瘤抑制性免疫微环境中的免疫抑制细胞，降低其免疫抑制能力等。程序性死亡受体1（PD-1）是T细胞活化的负调节，通过与其两个配体PD-L1、PD-L2相互作用来限制T细胞的活性。抑制免疫负调控取得了突破性进展，例如抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1等免疫检查点单抗阻断质量，开创了癌症治疗新时代。目前应用于临床研究的PD-1或者PD-L1抗体，通过阻断PD-1或者PD-L1通路，部分恢复T细胞的功能，使其能够继续杀伤肿瘤细胞具有治疗多种类型肿瘤的潜力。恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状上皮细胞癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌等都均显示良好的临床疗效。且PD-1和PD-L1的单抗已被美国食品药品监督局（FDA）批准用于复发或难治性恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌的治疗。本技术方案采用的是第四代的CAR结构，CAR-T细胞在识别CD133同时能够分泌细胞因子如IL12或者PD-1的抗体，分泌的细胞因子如IL12会加强CAR-T细胞自身的杀伤功能，同时招募其他的免疫细胞如DC细胞同时对肿瘤细胞杀伤；分泌的PD-1抗体可以阻断肿瘤细胞表面PD-L1分子与CAR-T细胞的结合，从而解除PD-L1对CAR-T细胞的抑制作用，本技术方案因此能够提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，该CAR-T细胞表达CD133-CAR同时可以分泌抗体或细胞因子，能更好的克服肿瘤微环境的免疫抑制，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。本专利技术要解决的技术问题之二是提供该分泌型靶向CD133的CAR-T细胞的制备方法，该方法能够制备出既有细胞杀伤毒性，又能高水平表达抗体或细胞因子的细胞。本专利技术要解决的技术问题之三是提供该分泌型靶向CD133的CAR-T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。这些分泌scFv的CAR-T细胞以旁分泌和自分泌方式起作用，以改善CAR-T细胞和肿瘤特异性T细胞抗肿瘤活性。scFv的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都起到关键的决定因素。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：在本专利技术的第一方面，提供分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，包括如下细胞：表达CD133-CAR的同时分泌抗体的T细胞；表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子的T细胞。在本专利技术中，术语CD133-CAR指CD133嵌合抗原受体，包含有靶向CD133的scFv序列。scFv：全称single-chainantibodyfragment，即单链抗体片段。在本专利技术中，术语CD133-scFv指抗CD133单链抗体片段，进行密码子优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；该核苷酸序列用于慢病毒表达载体上、逆转录病毒载体上、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或者其他类型的表达载体上，优选为慢病毒表达载体上。作为本专利技术优选的技术方案，所述的表达CD133-CAR的同时分泌抗体的T细胞，其抗体优选为PD-1抗体。作为本专利技术优选的技术方案，所述的表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子的T细胞，其细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌型靶向CD133的CAR‑T细胞，其特征在于，包括表达CD133‑CAR的同时分泌抗体的CAR‑T细胞和表达CD133‑CAR的同时分泌细胞因子的CAR‑T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞，其特征在于，包括表达CD133-CAR的同时分泌抗体的CAR-T细胞和表达CD133-CAR的同时分泌细胞因子的CAR-T细胞。2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的抗体为PD-1抗体，细胞因子为IL12细胞因子。3.如权利要求1或2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的CD133-CAR包含scFv区域，该scFv区域用于识别CD133抗原，该scFv区域序列为经过优化的核苷酸序列，序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1或2所述的分泌型靶向CD133的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒；（2）将携带CD133-CAR及抗体或细胞因子基因的重组慢病毒质粒及辅助质粒转染宿主细胞，制备可感染T细胞的重组慢病毒载体；（3）从供者提供的外周血中分离PBMC，使用磁珠分离、活化T细胞；（4）将步骤（2）所得的重组慢病毒载体转导进入T细胞，产生表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞；（5）将步骤（4）所得细胞体外培养；（6）将步骤（5）所得细胞大量扩增；（7）收集表达CD133-CAR的同时分泌抗体或细胞因子的CAR-T细胞。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的CD133-CAR所包含的scFv区域为优化密码子后得到的序列，如SEQIDNO.1所示。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是二代或者三代的慢病毒转基因质粒。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的重组慢病毒质粒是第三代慢病毒转基因质粒；所述的重组慢病毒质粒是靶向CD133抗原且分泌IL12细胞因子的慢病毒转基因质粒，重组慢病毒质粒依次包含CMV启动子序列、CD133单链抗体、C-myc表位标记、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区、NFAT启动子序列、IL12细胞因子序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚小云，李甲璐，王丹，沈慧，马丽，许先进，刘慧莹，
申请(专利权)人：苏州茂行生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32