新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用。所述的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT‑NBSC，其保藏编号CCTCC NO：C2018201。试验发现，hTERT‑NBSC可以连续传代65代以上，且生长增殖特性保持不变。该细胞系对接种ORFV较为敏感，可以高效增殖ORFV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞系所增殖的ORFV病毒滴度与新生牛睾丸支持细胞相当，且细胞分种率高于NBSC，分种率可达1:3。同时利用该传代细胞系来制备疫苗，简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，同时还保证了制备得到的羊传染性脓疱病疫苗的质量稳定。因此，本发明专利技术的提出对羊传染性脓疱病疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

Establishment and application of immortalized bovine testicular Sertoli cell line

The invention discloses an immortalized bovine testicular Sertoli cell line and its establishment method and application. The immortalized bovine testicular Sertoli cell line is named as the immortalized bovine testicular Sertoli cell line hTERT_NBSC, and its preservation number is CCTCC NO:C2018201. It was found that hTERT NBSC could be subcultured continuously for more than 65 generations, and the growth and proliferation characteristics remained unchanged. The cell line is sensitive to ORFV inoculation, and can efficiently proliferate ORFV, and ensure the uniformity and stability of the virus. The viral titer of ORFV proliferated by this cell line was similar to that of Sertoli cells of newborn bovine testis, and the cell differentiation rate was higher than that of NBSC, and the cell differentiation rate could reach 1:3. At the same time, the cell line was used to prepare the vaccine, which simplified the production process, shortened the production cycle and reduced the production cost. At the same time, the quality of the vaccine was stable. Therefore, the invention provides a new technical means for the large-scale production of sheep infectious pustulosis vaccine.

【技术实现步骤摘要】
新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和应用
本专利技术涉及一种永生化细胞系及其建立方法和应用，特别涉及一种新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系及其建立方法和在培养、增殖培养羊传染性脓疱病毒中的应用。本专利技术属于细胞工程

技术介绍
睾丸支持细胞(Sertolicell,SC)是生精小管基膜上的上皮细胞，是生精小管内唯一的体细胞。在结构上为生精细胞的分化成熟提供支架，为生精细胞提供支持、营养和保护作用，被称为生精细胞的“保姆细胞”。在精子的分化成熟过程中，支持细胞不但向生精上皮传递促性腺激素，控制生精细胞的有丝分裂、减数分裂及后续分化一系列动态过程，而且对精细胞具有支持、营养、吞噬、释放、分泌等多种功能。其分泌的雄激素结合蛋白(androgenbindingprotein,ABP)、苗勒氏管抑制物质(mullerianinhibitingsubstance,MIS)、抑制素(inhibin)、激活素(activin)、转化生长因子β(TGFβ)、胰岛素样生长因子1(IGF1)、白介素1和6(IL1，IL6)、生精生长因子(spermatogenicgrowthfactor,SGF)、神经营养素3(neurotrophin3,NT3)、神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)等，参与生精细胞的分化成熟并协调和保证精子的发生正常有序进行。睾丸支持细胞强大的分泌功能和免疫豁免功能，已成为细胞联合培养、组织工程及器官移植领域的研究热点之一，在临床移植领域中也具有良好的应用前景。研究发现将大鼠胰岛细胞和大鼠睾丸支持细胞联合微囊化后培养11d，胰岛细胞和支持细胞联合微囊化组的胰岛功能明显好于胰岛细胞和支持细胞分别微囊化的共同培养组及胰岛单独微囊组。将这种联合培养的微囊胰岛置入门静脉可能是未来临床治愈糖尿病的重要途径。另外,发现支持细胞在体外对胰岛B细胞的增殖有显著的促进作用,同时可以使胰岛细胞由成熟状态逆转为幼稚状态,并使胰岛素的分泌水平显著高于对照组。近年有学者将睾丸支持细胞与干细胞体外共培养，结果发现睾丸支持细胞对体外培养的干细胞有促进干细胞的生长的作用。羊传染性脓疱病(Contagiousecthyma,CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagiouspustulardermatitis)，俗称“羊口疮(Orf)”，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患传染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。该病最早发现于欧洲，目前，几乎所有养羊国家和地区均存在。现有流行病学调查研究资料显示，成年羊群中即使采用抗病毒药物以及抗生素治疗，发病率仍为60％，死亡率为24.7％，羔羊的死亡率高达93％。因此，该病一旦发生，将给养羊户造成重大的经济损失，严重危害肉羊产业的健康发展，更为严重的是此病可以通过伤口感染饲养人员，表现为感染者手背、指间和前臂部出现疱疹和破溃。例如2005年8月中国福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病,2013年6月云南省玉溪市江川县动物疾病预防与控制中心一名工作人员在给发病羊采样和拍照时不慎被羊咬伤手指而感染该病。因此，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。对于病毒性传染病快速、有效的分离病原是诊断和疫病防控工作的关键。可以持续增殖该病毒的细胞是病毒诊断和后续研究最重要的工具之一。ORFV可在牛、羊的皮肤细胞、肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞上生长，并产生细胞病变，但是病毒滴度低,据最近研究表明利用胎羊鼻甲骨粘膜上皮细胞(OFTu)分离羊传染性脓疱病毒具有细胞培养方便、分离病毒效率高、病毒增殖效价高等优点，但存在获取该细胞比较复杂(需要羊胚胎),在疫苗生产中需要大量的动物提供组织等问题。在中国，虽然青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所已研制出羊传染性脓疱弱毒疫苗，但其制备工艺复杂、落后，繁殖羊传染性脓疱弱毒抗原必须用新生牛睾丸原代细胞。而制备这种细胞程序复杂，生产成本高，生产效率较低下，这给疫苗厂规模化生产羊传染性脓疱弱毒疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，每次繁殖羊口疮抗原所用的新生牛睾丸品种不一，这就很难保证生产的弱毒疫苗的质量稳定性，此外，新生牛睾丸还有携带其他病原的潜在危险。因此，研发一种适于羊传染性脓疱病毒增殖的传代细胞系，对疫苗企业具有非常重要的现实意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术专利技术人采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入前期已建立的有限传代细胞系—新生牛睾丸支持细胞系NBSC(保藏编号CCTCCNO：C201438)中，对新生牛睾丸支持细胞系NBSC进行永生化改造。获得新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系(hTERT-NBSC)。在本专利技术中，优选的，所述的新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC，分类命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号CCTCCNO：C2018201，保藏时间为2018年10月12日。本专利技术的一种新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC是通过以下步骤制备得到的：(1)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT分别导入前期已建立的有限传代细胞系—新生牛睾丸支持细胞系NBSC(保藏编号CCTCCNO：C201438)中，利用浓度为300μg/mL的G418进行筛选，得到抗G418阳性细胞克隆，从筛选的抗G418阳性细胞克隆中提取RNA，利用RT-PCR方法检测发现，检测代次的抗G418阳性细胞均表达了hTERT基因。表明hTERT基因成功的转入NBSC细胞中，并得到有效表达。该筛选得到的抗G418阳性细胞命名为hTERT-NBSC。(2)通过有限稀释法将步骤(1)获得的hTERT-NBSC细胞传至96孔板中，挑取其中只有单个细胞长成的克隆孔，再扩大培养到获得单克隆的hTERT-NBSC细胞株。(3)将筛选获得的单克隆hTERT-NBSC细胞株进行细胞生物学特性测定。其中，将筛选获得的hTERT-NBSC单克隆细胞株分别接种6孔板，观察细胞分种率，细胞长满单层时间；接种ORFV细胞毒各单克隆细胞株产生CPE情况。hTERT-NBSC单克隆细胞株，分种率为1:3，长满单层时间48小时左右，接种ORFV细胞强毒75％产生CPE所需时间均为65小时左右。其中，将筛选获得的hTERT-NBSC单克隆细胞3#、5#，进行连续传代，记录每一代次细胞长满单层的时间。hTERT-NBSC单克隆细胞株每传5代，接种同一代次的ORFV细胞强毒(lgTCID50≥6.0)，观察ORFV对hTERT-NBSC单克隆细胞株的CPE，并测定其TCID50。试验证实，hTERT-NBSC单克隆细胞3#、5#在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT‑NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2018201，保藏时间为2018年10月12日。

【技术特征摘要】
1.新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系hTERT-NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCCN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王光祥，张志东，王艳华，秦晓东，李彦敏，杨能能，贾宁，苏雅杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62