构建FSCN1基因稳定敲除细胞系方法及质粒或质粒组合和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及一种构建FSCN1基因稳定敲除细胞系方法及质粒或质粒组合和应用。本发明专利技术的目的是针对siRNA转染瞬时敲降FSCN1方法的不稳定性和不彻底性，提供一种从基因组中稳定敲除FSCN1基因的方法，该方法除了用于研究FSCN1功能外，还可以用于构建FSCN1基因敲除细胞系。本发明专利技术所提供的基于CRISPR‑Cas9系统构建FSCN1基因敲除细胞系的方法，所述方法以人FSCN1基因第一外显子中的蛋白编码序列和第五外显子中的蛋白编码序列中符合5‘‑G‑N18‑NGG‑3或5‘‑G‑N20‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N18‑C‑3’或5’‑CCN‑N20‑C‑3’序列规则排列的片段的“N18或N20”为靶序列；N表示A、T、C、G中的任一种，其中“N18”和“N20”分别为18和20个脱氧核苷酸。

Construction of stable knockout cell lines of FSCN1 gene and combination and application of plasmids or plasmids

The invention belongs to the technical field of molecular biology, and relates to a method for constructing a stable knockout cell line of FSCN1 gene and the combination and application of plasmids or plasmids. The aim of the present invention is to provide a method for stably knocking out FSCN1 gene from genome in view of the instability and incompleteness of the instantaneous knockdown method of siRNA transfection. The method can be used not only to study the function of FSCN1, but also to construct a FSCN1 knockout cell line. The present invention provides a method for constructing a FSFSCN1 gene knockout cell line based on CRRISPR Cas9 system, which is a method for constructing a FSFSCN1 gene knockout cell line based on RISPR Cas9 system. The method comprises a protein codcodcodcodcodcodcodsequence in the first exexexexexexexexexexexexexexexexexexexexexgene of human FSCNCN1 gene and a protein codcodcodcodcodcodcodcodcodcodcodcodcodcodcodcodcod3 or 3 or 5 ```8209G G 82099N1N1N18 8209 N18 8209 8209 NGG 8208209 NG 8208208209 N20 8209 N20 8208208209 NG 8208208209 NGG 8209 9 9 9 9 9 9 9 3'Sequence Regular Arrangement of Slices Segment \N18 or N20\ is the target sequence; N represents any of A, T, C and G, where \N18\ and \N20\ are 18 and 20 deoxynucleotides, respectively.

【技术实现步骤摘要】
构建FSCN1基因稳定敲除细胞系方法及质粒或质粒组合和应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种构建FSCN1基因稳定敲除细胞系方法及质粒或质粒组合和应用。
技术介绍
喉鳞癌(Laryngealsquamouscellcarcinoma，LSCC)原发于喉黏膜上皮，居头颈部恶性肿瘤第2位，近年来在我国的发病率呈上升趋势。在肿瘤细胞的生物学特征中，侵袭转移作为恶性肿瘤的主要特征，是引起恶性肿瘤患者死亡的首要因素。据临床数据统计，超过80％的肿瘤患者死于侵袭转移。而喉部具有组织结构疏松、黏膜下淋巴组织丰富等特点，使得喉鳞癌具有局部侵袭和早期颈淋巴结转移的恶性生物学行为。患者一旦发生颈淋巴结转移，通常治疗效果较差，且5年生存率显著下降。FSCN1(fascinactin-bundlingprotein1，聚束蛋白)属于Fascin家族。人类FSCN1基因定位于染色体7p22.1，编码的蛋白质由493个氨基酸残基组成，分子量为55kD，包括两个肌动蛋白结合位点，分别位于aa33-47和aa277-493。FSCN1可促进微丝成束，在细胞骨架结构调节和质膜突起形成过程中发挥作用。FSCN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，是采用基于CRISPR‑Cas9系统构建FSCN1基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以人FSCN1基因第一外显子中的蛋白编码序列和第五外显子中的蛋白编码序列中符合5‘‑G‑N18‑NGG‑3或5‘‑G‑N20‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N18‑C‑3’或5’‑CCN‑N20‑C‑3’序列规则排列的片段的“N18或N20”为靶序列；N表示A、T、C、G中的任一种，其中“N18”和“N20”分别为18和20个脱氧核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，是采用基于CRISPR-Cas9系统构建FSCN1基因敲除细胞系，其特征在于：所述方法以人FSCN1基因第一外显子中的蛋白编码序列和第五外显子中的蛋白编码序列中符合5‘-G-N18-NGG-3或5‘-G-N20-NGG-3’或5’-CCN-N18-C-3’或5’-CCN-N20-C-3’序列规则排列的片段的“N18或N20”为靶序列；N表示A、T、C、G中的任一种，其中“N18”和“N20”分别为18和20个脱氧核苷酸。2.根据权利要求1所述的构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，其特征是：所述靶序列为Seq-No.1和Seq-No.2。3.根据权利要求1或2所述的构建FSCN1基因稳定敲除细胞系的方法，其特征是：所述方法为如下方法A或方法B或方法C：方法A，包括如下步骤：(a1)合成名称为正向单链DNA-1和名称为反向单链DNA-1的2个单链DNA，所述正向单链DNA-1的序列如Seq-No.3所示，反向单链DNA-1的序列如Seq-No.4所示；(a2)将所述正向单链DNA-1和反向单链DNA-1进行退火反应，得到双链DNA-1；(a3)将上述双链DNA-1连接到pSpcas9(BB)-2A-puro(PX459)V2.0质粒的限制性内切酶BbsⅠ的切割位点处，得到重组质粒，标记为pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-1；(a4)将所述pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-1质粒，转染Hep-2细胞，经嘌呤霉素筛选36小时后，采用极限稀释法获得单细胞克隆，从单细胞克隆中鉴定获得FSCN1基因敲除细胞系；方法B，包括如下步骤：(b1)合成名称为正向单链DNA-2和名称为反向单链DNA-2的2个单链DNA，所述正向单链DNA-2的序列如Seq-No.5所示，反向单链DNA-1的序列如Seq-No.6所示；(b2)将所述正向单链DNA-2和反向单链DNA-2进行退火反应，得到双链DNA-2；(b3)将上述双链DNA-2连接到pSpcas9(BB)-2A-puro(PX459)V2.0质粒的限制性内切酶BbsⅠ的切割位点处，得到重组质粒，标记为pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-2；(b4)将所述pSpcas9(BB)-gRNA-FSCN1-2质粒，转染Hep-2细胞，经嘌呤霉素筛选36小时后，采用极限稀释法获得单细胞克隆，从单细胞克隆中鉴定获得FSCN1基因敲除细...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红亮，吴勇延，高伟，汤叶美，殷宏雨，张宇良，牛敏，郑希望，薛绪亭，崔佳佳，
申请(专利权)人：山西医科大学第一医院，高伟，吴勇延，
类型：发明
国别省市：山西,14