一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用技术

一种人原代骨肉瘤细胞株NEO217‑luc及其构建方法和应用，所述细胞株NEO217‑luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018179。该细胞株NEO217‑luc的细胞有重叠生长的能力，细胞异型性明显，具有骨肉瘤细胞的形态特征，是一株新建的人骨肉瘤肿瘤细胞系，可在培养基中进行体外培养，且体外培养生长快速稳定、能连续传代，进而方便建立骨肉瘤免疫缺陷小鼠体外模型；免疫缺陷鼠皮下成瘤性好，且肿瘤随着时间的延长生长迅速且浸润性强，为药物的体内试验提供了重要的保证，可作为骨肉瘤发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，可应用于制备、筛选、评价抗脊柱骨肉瘤药物。

A Primary Human Osteosarcoma Cell Line NEO 217-luc Derived from Spine and Its Construction Method and Application

A human primary osteosarcoma cell line NEO 217 Luc and its construction method and application are described. The cell line NEO 217 Luc is stored in a typical culture preservation center in China. Address: Wuhan University, Wuhan City, China. The preservation number is CCTCC NO: C2018179. The cell line NEO 217 Luc has the ability of overlapping growth, obvious cell heteromorphism and morphological characteristics of osteosarcoma cells. It is a new human osteosarcoma cell line, which can be cultured in vitro in culture medium. It can grow rapidly and steadily in vitro, and can be passed on continuously, thus facilitating the establishment of an in vitro model of osteosarcoma immunodeficient mice. It has good tumorigenicity, rapid growth and strong infiltration over time, which provides an important guarantee for in vivo drug testing. It can be used as a cell material for in vitro study of the pathogenesis and individualized treatment of osteosarcoma, and can be used to prepare, screen and evaluate anti-spinal osteosarcoma drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用。
技术介绍
骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一。然而脊柱骨肉瘤非常罕见，患病率仅占所有原发性骨肉瘤的3％。虽然骨肿瘤外科医生建议对任何原发性骨肉瘤进行大范围的切除术，但是与四肢骨肉瘤相比，脊柱骨肉瘤的预后较差。在过去的几十年里，已经有一些关于人骨肉瘤细胞系建立的报道。然而很少有人建立脊柱骨肉瘤细胞系，这使得研究脊柱骨肉瘤的生物学行为变得困难。因此，建立脊柱骨肉瘤细胞系作为临床相关的脊柱骨肉瘤模型来研究其生物学行为具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用，该种新型人原代骨肉瘤细胞株，为研究病人体内骨肉瘤的发生、耐药机制及治疗提供良好的体外模型，进而促进脊柱骨肉瘤的基础研究、预防及临床诊治。为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，该细胞株NEO217-luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCCNO：C2018179。本专利技术还提供了所述人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc的构建方法，其包括如下步骤：1)将脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将标本反复剪切至糜状，移入装有10mlDMEM培养基的无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)，放入恒温振荡仪中在37℃下以200次/min的速度进行振荡，振荡2小时候后取出、用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将收集的液体缓慢加入到预盛5mlFicoll淋巴细胞分离液的无菌离心管中，放入离心机中2500转/min、离心30min；离心完毕后取出，将中间的细胞层用吸管小心吸出置入另一离心管中，5mLPBS对吸出的细胞层吹打、重悬，再次离心，去上清后底部即为分离所得的组织细胞；2)将步骤1)处理获得的组织细胞接种于细胞培养瓶中，加入含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)的DMEM培养基，将细胞培养瓶放置在温度设定为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；培养第3天进行半量换液一次，第5天进行全量换液一次，第7天用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶将贴壁细胞消化后进行1：2传代；3)将传代的细胞接种于新的细胞培养瓶中，加入含有10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)的DMEM培养基进行培养；在培养的过程中，挑选不同代数的细胞进行冻存保种，收集细胞后将细胞用冻存液重悬，将冻存管放入液氮罐中保存，将该细胞系命名为NEO217。4)将荧光素酶基因(Fireflyluciferase基因)整合到细胞NEO217染色体DNA上，使细胞表达荧光素酶，构建出稳定表达荧光素酶的细胞株。本专利技术通过对NEO217进行luciferase基因修饰后，这种细胞株在进行动物体内实验时，将稳定细胞株接种到动物体内，一定时间后腹腔注射底物荧光素(luciferin)，在几分钟可以发光，即可用仪器检测，发光强度与细胞的数目相关，使体内实验更加直观，方便掌握实验时间及进程等。我们将这种携带荧光素酶基因的NEO217进一步命名为NEO217-luc，得到保藏编号为CCTCCNO：C2018179的人原代骨肉瘤细胞株。本专利技术上述构建方法得到的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc经染色体G带核型分析表明其存在染色体异常。经裸鼠致瘤实验证实：本专利技术的所述人原代骨肉瘤细胞株能够导致裸鼠成瘤，具有致瘤性。本专利技术还提供所述人原代骨肉瘤细胞株在建立人脊柱骨肉瘤发生机理模型中的应用。本专利技术还提供所述人原代骨肉瘤细胞株在建立体外的人脊柱骨肉瘤动物模型中的应用。本专利技术还提供所述人原代骨肉瘤细胞株可应用于制备、筛选、评价抗脊柱骨肉瘤药物中的应用。本专利技术建立的人原代骨肉瘤细胞系可用于研究脊柱骨肉瘤的有用分子工具，将有助于理解与这些癌症的发展相关的分子事件。此外，该细胞系可用于测试新的治疗策略以初步预测其功效。本专利技术的有益效果：本专利技术构建了一种新型人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，该细胞株来源于脊柱，其细胞有重叠生长的能力，细胞成多角形，核大，胞浆相对较少，核仁1-2个，细胞异型性明显，具有骨肉瘤细胞的基本形态特征，符合建系标准，是一株新建的人骨肉瘤肿瘤细胞系。本专利技术构建的人原代骨肉瘤细胞株可在培养基中进行体外培养，且体外培养生长快速稳定、能连续传代，进而方便建立骨肉瘤免疫缺陷小鼠体外模型；免疫缺陷鼠皮下成瘤性好，且肿瘤随着时间的延长生长迅速且浸润性强，良好的成瘤性为药物的体内试验提供了重要的保证，可作为骨肉瘤发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，进而为制备、筛选、评价抗肿瘤药物提供基础。附图说明图1为本专利技术实施例1倒置相差显微镜下新型人骨肉瘤细胞株细胞照片。图2为本专利技术实施例1中骨肉瘤细胞株细胞透射电镜图片。图3为本专利技术实施例2中骨肉瘤细胞株细胞生长周期。图4为本专利技术实施例3中骨肉瘤细胞株细胞生长曲线。图5为本专利技术实施例4中骨肉瘤细胞株细胞染色体分析结果。图6为本专利技术实施例5中骨肉瘤细胞株细胞与MNNG/HOS和MG63细胞侵袭能力对比图。图7为本专利技术实施例5中骨肉瘤细胞株细胞与MNNG/HOS和MG63细胞迁移能力对比图。图8为本专利技术实施例6中骨肉瘤细胞株细胞在免疫缺陷小鼠皮下致瘤后皮下肿瘤的HE染色结果。图9为本专利技术实施例6中骨肉瘤细胞株细胞异种移植瘤组织HE染色结果。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明。本专利技术所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1原代培养和脊柱骨肉瘤细胞系的建立脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本一部分送往病理科进行病理学检测证实为骨肉瘤，另一部分标本装入盛有Hank`s液的50ml无菌离心管中立即送往细胞培养室进行后续的处置工作。在细胞超净工作台中将离心管中的标本倒入10cm的无菌培养皿中，用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将组织块反复剪切至糜状，将组织移入装有10mlDMEM培养基(Gibco，USA)的50ml无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)，放入恒温振荡仪中在37℃的条件下以200次/min的速度进行振荡，2小时候取出后用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将其壁缓慢加入到预盛5mlFicoll淋巴细胞分离液的15毫升无菌离心管中，放入离心机中2500转/min水平离心30min。离心完毕后取出，将中间的细胞层小心用吸管吸出置入另一离心管中，5毫升PBS对其吹打本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217‑luc，其特征在于，所述细胞株NEO217‑luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCC NO：C2018179。

【技术特征摘要】
1.一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，其特征在于，所述细胞株NEO217-luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCCNO：C2018179。2.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc的构建方法，包括如下步骤：1)将脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将肿瘤标本反复剪切至糜状，移入装有10mlDMEM培养基的无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素、链霉素，放入恒温振荡仪中在37℃下以200次/min的速度进行振荡，振荡2小时后取出、用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将收集的液体缓慢加入到预盛5mlFicoll淋巴细胞分离液的无菌离心管中，放入离心机中2500转/min、离心30min；离心完毕后收集中间的细胞层，PBS对吸出的细胞层吹打、重悬，再次离心，去上清后底部即为分离所得的组织细胞；2)将步骤1)处理获得的组织细胞接种于细胞培养瓶中，加入DMEM培养基，将细胞培养瓶放置在温度设定为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；培养第3天进行半量换液一次，第5天进行全量换液一次，第7天用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶将贴壁细胞消化后进行1：2传代；3)将传代的细胞接种于新的细胞培...

【专利技术属性】
技术研发人员：周振华，肖建如，胡硕，王旭东，张薇薇，匡牧宇，龚德军，贾奇，李焱，曹佳实，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：上海,31